Maduración, activación, diferenciación de linfocitos T, Inmunoglobulinas y otras moléculas de células B, complejo mayor de histocompatibilidad y vacunas. grupo 2

Universidad tecnológica 

de Santiago (utesa)

Asignatura

Inmunología.

Presentado a:

DRA. Mirtha billar

Temas:

Maduración, activación, diferenciación de linfocitos T, 

Inmunoglobulinas y otras moléculas de células B, 

complejo mayor de histocompatibilidad 

y vacunas.

Agrupación # 2

Nombres y matriculas:

Dharlyn Gómez  2-10-0930

Jessica paulino 1-10-0745

Carl wenders 1-11-2545

Anny genao 2-10-1704

Esenlander presendiu 2-11-0617

Judeline jeudy 1-11-2221

Farlyn inoa 2-11-1637

Nathalie Castillo 1-10-0491

Erase wislande 2-10-5810

Jinette Pérez 1-10-1095

Wilkeny Joseph 1-11-2595

Maduración, activación, diferenciación de los linfocitos T

  

El receptor clonotípico de las células T (TCR) presenta dos funciones principales según la fase de desarrollo en que se encuentre la célula dentro del linaje de los linfocitos T:

    

Durante la maduración de los timocitos en el timo, participa en la selección tímica positiva y negativa.

   

Una vez que el linfocito T ha madurado, emigra a la periferia, y entonces el receptor participa en el reconocimiento de antígenos, lo que desencadena un programa de activación que lleva a la proliferación y diferenciación de las células T en dos subclones: uno de células efectoras, y otro de células de memoria.

El proceso de reconocimiento varía según que hablemos de TCR-2 (a b ) o del TCR-1 (g d ): en el primer caso, y como ya hemos visto, se reconocen péptidos en el contexto del haplotipo propio del MHC clásico, y se requieren moléculas coestimuladoras y coseñalizadoras, notablemente la CD4 (para linfocitos TH) o la CD8 (para los linfocitos TC); en el caso del g d , no se requiere MHC clásico, y no participan CD4 ni CD8.

Refiriéndonos a los linfocitos con receptores de tipo a b, podemos hacer un avance resumido de estos procesos de maduración y activación:

·       

  Maduración: la enorme diversidad antigénica potencial se reduce a un 2% durante la maduración intratímica de los timocitos: sólo llegan a madurar aquellas células restringidas a reconocer lo no-propio en el contexto del haplotipo MHC propio (autorrestricción y autotolerancia). Las fases finales de la maduración ocurren por dos rutas de desarrollo diferentes que generan dos subpoblaciones: linfocitos CD4+(restringidos por MHC-II) y linfocitos CD8+ (restringidos por MHC-I).

·         

Activación: La activación de células T maduras periféricas se inicia con la interacción entre el TCR y un péptido antigénico enclavado en la hendidura del MHC. Como ya comentamos, la baja afinidad (10-5M) de esta interacción ternaria se ve potenciada por la presencia de correceptores y otras moléculas de membrana, que funcionan para fortalecer la interacción ternaria TCR-péptido-MHC, y para transducir la señal activadora al interior de la célula T. Ello desencadena la proliferación clonal y diferenciación en dos subpoblaciones, una de T efectoras y otra de T de memoria.

MADURACIÓN DE LAS CÉLULAS T

    Desarrollo del timo:

    El estroma tímico surge al inicio del desarrollo embrionario a partir de capas ectodérmicas y endodérmicas procedentes del tercer bolsillo faríngeo y de la tercera hendidura branquial. Estas dos estructuras se invaginan, y se cierran, y las dos capas quedan superpuestas, de modo que la ectodérmica rodea a la endodérmica, formando el llamado rudimento tímico.

·         La capa ectodérmica formará los tejidos epiteliales corticales del timo;

·         La capa endodérmica formará los tejidos epiteliales medulares.

            El rudimento tímico atrae entonces a células de origen hematopoyético, que lo colonizan: células dendríticas, macrófagos y precursores de timocitos. Al nacer, los humanos tienen ya plenamente desarrollado el timo.

·         En su corteza encontramos sólo timocitos en fases tempranas de su maduración, junto con algunos macrófagos.

·         En la médula encontramos timocitos en fases más avanzadas de maduración con células dendríticas y macrófagos, todos inmersos en un estroma medular a base de células epiteliales medulares.

Rutas de desarrollo en el linaje de las células T

El primer marcador de superficie en aparecer es el CD2, que ya no se pierde (por lo tanto, se trata de un marcador que caracteriza al linaje de T). Estas células pueden escoger dos vías alternativas:

1.      En una de las dos rutas, las células hacen reordenaciones productivas de g y d y expresan CD3 en su membrana. Suponen sólo <1% de los timocitos. Son las primeras en aparecer: se detectan al día 14 de gestación, pero desaparecen al nacimiento.

2.      La mayoría escoge una vía alternativa, que discurre de la siguiente manera:

·         día 16º: Las células reordenan genes de cadenas β. Si no se logran reordenaciones productivas, entran en apoptosis. Si la reordenación es productiva, la cadena b se asocia con la llamada cadena a sustitutiva, generando el receptor pTa:b (junto con CD3)  induciendo la proliferación celular y la coexpresión de CD4 y CD8: de este modo aparecen los timocitos grandes doble positivos. El receptor pTa:b también induce la reordenación de genes de cadenas a.

·         Día 17º: CD4+ CD8+ TCR-2+ (a b ) CD3+. Se trata de los pequeños timocitos dobles positivos, que dejan de dividirse. Estas células ya provistas del complejo receptor específico van a ser sometidas, hasta la época del nacimiento (en que alcanzan sus máximos niveles), a selección positiva y negativa:

·         selección positiva: sobreviven aquellas células que tengan TCR capaces de reconocer MHC-I o MHC-II de células epiteliales del timo. Con ello se garantiza la restricción por propio haplotipo de las células T.

·         selección negativa: de aquellas células que han pasado la selección positiva mueren por apoptosis las que posean TCR que reconozcan con alta afinidad péptidos propios enclavados en el MHC o MHC propio solo. Ello tiende a garantizar la propiedad de autotolerancia por eliminación de los linfocitos T autorreactivos.

·         Los timocitos dobles positivos que superan la doble selección tímica se desarrollan en una de dos posibles rutas alternativas:

·         CD4+ CD8- TCR-2+ CD3+ (representan el 10% de timocitos)

·         CD8+ CD4- TCR-2+ CD3+ (un 5% de los timocitos)

·         adicionalmente, y quizá procedente de los anteriores, al 5º día del nacimiento se detecta una tercera subpoblación de CD4- CD8- TCR+ CD3+.

               

Estas poblaciones abandonan el timo como linfocitos T maduros vírgenes, y circulan por la periferia, pudiéndose establecer en órganos linfoides secundarios (ganglios) y recirculando continuamente entre sangre y linfa, a la espera de que en uno de sus asentamientos en ganglios llegue a encontrar su antígeno; si no lo encuentra, muere al cabo de unas 5 a 7 semanas.

Localización intratímica de las diversas fases madurativas:

·         Los timocitos doble negativos se localizan en la zona subcapsular de la corteza.

·         Los pequeños timocitos dobles positivos se localizan en la corteza.

·         Los timocitos maduros CD4+ y CD8+ se ubican en la médula.

·         En la corteza, las células epiteliales corticales establecen contactos por sus largos procesos de membrana con los timocitos.

Selección tímica positiva y negativa

En ambos procesos selectivos parecen jugar un papel importante las células del estroma tímico: células epiteliales tímicas, macrófagos y células dendríticas; todas ellas expresan en sus membranas grandes niveles de moléculas MHC-I y/o MHC-II. Los timocitos inmaduros dobles positivos (CD4+ CD8+ TCR+ CD3+) interaccionan, por mecanismos aún oscuros, con estas células estromales, lo que conduce a la selección positiva y negativa.

En la selección positiva se da interacción de los timocitos con células epiteliales corticales del timo (Las células corticales epiteliales van provistas de largos procesos de membrana que permiten contactos simultáneos con varios timocitos). Algunos autores han sugerido la interacción de los timocitos inmaduros dobles positivos con dichas células epiteliales por medio del TCR restringido por MHC podría conllevar algún tipo de señal protectora que librara a estos timocitos de la muerte celular programada; en cambio, la apoptosis afectaría a los timocitos no restringidos por MHC propio.

De los timocitos que sobreviven a la selección positiva algunos llevan TCR de baja afinidad hacia auto-péptidos presentados por MHC, y otros llevan TCR con alta afinidad hacia auto-péptidos presentados por ese MHC: estos últimos sufren selección negativa, que ocurre en la zona de transición cortico-medular y en la médula tímica, y en la que las células dendríticas y los macrófagos interaccionan con los timocitos portadores de TCR de alta afinidad hacia {autopéptidos-MHC} o hacia MHC solo.

Los auto-péptidos que inducen la selección negativa son aquellos derivados de proteínas expresadas en el mismo timo, así como aquellos procedentes de proteínas ubicuas que llegan al timo por la circulación.

Así pues, la autotolerancia se consigue eliminando células T (en realidad sus precursores inmaduros, timocitos) autorreactivas, y permitiendo el desarrollo de las específicas que reconocen péptidos extraños (no-propios) enclavados en el MHC propio (una combinación que alguien ha denominado como "lo propio alterado").

    La selección positiva también regula otros dos fenómenos en los que no nos vamos a detener:

·         Regulación de reordenaciones de cadenas a: la expresión en membrana del TCR no es suficiente para desconectar los genes de RAG y de TdT, de modo que continúa la reordenación de segmentos génicos de cadenas a, pudiéndose dar el caso de que una misma célula pueda tener dos tipos de TCR que tienen en común sus cadenas b, pero que difieren en las cadenas a, si bien sólo uno de ellos será funcional.

·         La selección positiva también regula la expresión del correceptor (CD4 o CD8) en las células maduras (es decir, el hecho de que dejan de ser doble positivas para convertirse en CD4+ o CD8+). Ello depende a su vez de la especificidad del TCR por la clase de MHC (I o II). El mecanismo de esta retención selectiva de sólo uno de los correceptores es aún objeto de investigación y debate.

ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T COADYUVANTES

La activación y expansión clonal de TH es un acontecimiento central en la producción de las respuestas inmunes específicas (tanto la humoral como la celular). Se trata de un proceso complejo que en los últimos años está siendo paulatinamente desentrañado. Antes de entrar en detalles, podemos resumirlo para tener una idea general:

·         los linfocitos T vírgenes son células en reposo que se encuentran "aparcadas" en la fase G0 del ciclo celular. La activación, proliferación y diferenciación de estas células es un fenómeno complejo.

·         La activación se inicia cuando el linfocito TH interacciona, a través de su complejo TCR-CD3, con el antígeno peptídico (exógeno) -procedente de procesamiento endosómico- enclavado en el surco de MHC-II de una célula presentadora. En esta interacción inicial, y en la señal que se va a producir, participan, además, moléculas accesorias, como el correceptor CD4.

·         Esta interacción inicial "dispara" una compleja cascada de acontecimientos bioquímicos, en la que son esenciales actividades quinasas y fosfatasas, y que culminan con la activación y expresión de diversos genes, entre los que se cuentan el de la IL-2 y el de su receptor.

·         La secreción autocrina de IL-2 por parte de los linfocitos TH hace que éstos salgan de la fase G0 y entren y progresen en el ciclo celular: ello provoca la proliferación y diferenciación de la célula T en dos subpoblaciones: una de células efectoras (las T coadyuvantes o colaboradoras) y las TH de memoria.

·         Pero para que ocurra esto se requieren, además señales coestimulatorias. Si tales señales químicas no se suministran al tiempo en que se está produciendo la interacción específica TCR-péptido-MHC, se induce un estado de incapacidad de respuesta inmune que se denomina anergia, que se manifiesta en tolerancia inmunológica hacia el estímulo antigénico.

Rutas de señalización intracelular

El TCR tiene colas citoplásmicas cortas que por sí mismas son incapaces de señalización intracelular. Una vez que dicho TCR se une al péptido:MHC, esta señal se transduce al interior de la célula T por medio de los dominios citoplásmicos de CD3, el correceptor CD4 y varias moléculas accesorias (CD2, CD45). Dicha transducción de señal se realiza por medio de una serie de proteín-quinasas y proteín-fosfatasas. Antes de pasar a ver las rutas bioquímicas de transducción de señal, haremos una breve descripción de algunas de estas enzimas implicadas.

                                     Algunas enzimas de la ruta de señalización

Ø Proteín-quinasas de la familia del protooncogén src

1) Proteína p56lck

·         Se trata de una proteín-quinasa que se une a membrana mediante ácido mirístico engarzado a la glicocola en posición 2 (Gly2).

·         Posee dos secuencias homólogas con otras proteínas (SH2 y SH3).

·         La SH2 participará en el reconocimiento de tirosinas fosforilables en la proteína diana.

·         La porción carboxiterminal es la que tiene actividad de quinasa. Obsérvese la existencia de dos tirosinas (representadas por Y): la que está en la posición 394 (denominada de regulación positiva) es la tirosina que se fosforila al activarse el linfocito T, mientras que la que está en posición 505 (llamada Tyr de regulación negativa) está fosforilada (Tyr-P) en las células T en reposo, y se desfosforila cuando las células se activan.

·         En el primer tercio se encuentra una cisteína que será la encargada de unirse por puente disulfuro con CD4 (o en el caso de TC, con CD8). También se asocia físicamente con las cadenas x y e del CD3.

2) Proteína p59 fyn

·         Su estructura es muy parecida a la de p56lck. También se encuentra anclada a la membrana por miristilación.

·         Igualmente posee una Tyr cerca del extremo carboxi-terminal, que cuando está fosforilada hace que la p59fyn esté inactiva, y otro sitio Tyr capaz de recibir fosfato por autofosforilación de esta quinasa, lo cual hace que la proteína pueda fosforilar a otras proteínas.

·         Está físicamente asociada a cadenas x del CD3.

Fosforilasa ZAP-70

·         No está asociada por miristilación a la membrana.

·         Contiene una Tyr capaz de autofosforilarse, pero a diferencia de las proteínas de la familia src, carece de Tyr de regulación negativa.

·         En las células T en reposo, la ZAP-70 no se encuentra asociada al complejo TCR-CD3; sin embargo, cuando se inicia el proceso de activación celular, y una vez que las cadenas x y e de CD3 quedan fosforiladas por otras proteín-quinasas, la ZAP-70, por medio de sus dominios SH2 se une a estas cadenas fosforiladas, y entonces queda activada en su capacidad de fosforilasa.

Ø Fosfatasa CD45 (=LCA=T200)

·         El CD45 es en realidad una familia de fosfatasas específicas de tirosina, que aparecen en todas las células del linaje hematopoyético excepto en los eritrocitos.

·         Existen varias isoformas, de entre 180-200 kDa, que proceden de procesamiento alternativo de un mismo tipo de ARN, y cada una de ellas aparece en determinados tipos celulares. Por ejemplo, CD45RA aparece en T vírgenes mientras que CD45R0 en T cebados.

·         Tiene un dominio extracelular, que está glucosilado; se une a la CD22.

·         Su porción citoplásmica es larga, y cuenta con dos dominios dotados de actividad fosfatasa de tirosinas (PTP).

·         Parece ser que una de sus funciones es desfosforilar la Tyr-P situada cerca del extremo carboxi-terminal de las proteín-quinasas (PTK) p56lck y p59fyn.

Modelo actual de la activación del linfocito TH

·         La señalización a través del complejo TCR-CD3 requiere que se agreguen muchos complejos junto con sus correspondientes correceptores CD4, y con CD45. Los numerosos conjuntos TCR-CD3-CD4 interaccionan simultáneamente con muchos complejos péptido:MHC-II de la célula presentadora de Ag (se requieren al menos unos 100 de tales complejos). Cada TCR se une al péptido antigénico enclavado en el MHC-II de la célula presentadora de antígeno. Al mismo tiempo, el CD4 interacciona (por su dominio extracelular) con el dominio b 2 de la MHC-II. Esta interacción parece que provoca un cambio conformacional que se transmite a las colas citoplásmicas de los polipéptidos del CD3 y del CD4. Ello induce la yuxtaposición de p56lck con las secuencias ARAM (=ITAM) de las proteínas de CD3.

·         Entonces, la actividad fosfatasa de CD45 provoca la desfosforilación de la tirosina fosforilada (Tyr-P) carboxi-terminal de p56lck y de p59fyn, lo que supone la activación de estas dos proteín-tirosínquinasas (PTK): se autofosforilan en la otra tirosina (la de regulación positiva).

·         La activación de las dos PTK citadas por autofosforilación provoca que a su vez éstas fosforilen las cadenas del complejo CD3, reconociendo las secuencias ARAM en x y en e . También se fosforila la cola

·         A las colas fosforiladas de CD3 y CD4 se une ahora la ZAP-70, de modo que ésta adquiere a su vez su actividad de proteínquinasa, con lo que puede fosforilar a cadenas del CD3 y a otras proteínas.

·         La ZAP-70 activa y la Fyn activa fosforilan a la fosfolipasa Cg 1 (PLCg 1), que originalmente es una proteína citoplásmica; al fosforilarse la PLCg1 se activa y emigra al lado citoplásmico de la membrana, reconociendo otras proteínas que tienen tirosinas fosforiladas. Al hacer esto, se facilita que la PLCg 1 entre en contacto con su sustrato: el fosfatidil-inositol-bifosfato (PIP2).

·         Entonces, la PLCg 1 hidroliza a este PIP2, generando inositol-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG), cada uno de los cuales suponen el arranque de sendas rutas dentro de esta compleja cascada activadora:

A) Ruta del inositol-trifosfato (IP3):

1.      El IP3 se une a un receptor específico situado en el REr, provocando la salida al citoplasma de grandes cantidades de Ca++, y junto con IP4 provoca también la entrada desde el exterior celular, a través de canales de calcio de la membrana citoplásmica, de más cantidades de este catión.

2.      El aumento intracelular de Ca++ estimula a la enzima calmodulina, que es una serín/treonín-quinasa.

3.      La calmodulina activada activa a su vez a la calcineurina, que es una fosfatasa.

4.      La calcineurina activada cataliza la desfosforilación del factor NF-AT citoplásmico fosforilado (NF-ATc-P).

5.      Una vez desfosforilado, el NF-AT emigra al núcleo, donde se junta con el factor nuclear AP1, formando entrambos un factor de activación transcripcional de varios genes, entre ellos el que codifica la citoquina IL-2.

Aparte de esta secuencia de acontecimientos, los altos niveles citosólicos de Ca++ pueden estimular igualmente a la proteín-quinasa C (PKC) y la quinasa MAP-II.

B) Ruta del diacilglicerol (DAG):

1.      El DAG estimula, junto con el Ca++, a la proteín-quinasa C (PKC), que hasta ese momento residía en el citoplasma.

2.      Al activarse, la PKC emigra a la cara interna de la membrana citoplásmica; allí, en presencia de los fosfolípidos, ejerce su función como serín/treonín-quinasa:

·         fosforila una amplia variedad de proteínas, entre las cuales se encuentra la codificada por el protooncogén ras. La proteína Ras a su vez inicia otra cascada de fosforilaciones que llega hasta las quinasas MAP. Estas quinasas parece que emigran al núcleo, donde activan por fosforilación a factores de transcripción.

·         c-fos y c-jun se unen para formar el ya citado AP1, que se une solo o junto con NF-AT, reconociendo en cada caso secuencias específicas de la zona promotora/intensificadora de ciertos genes.

·         otra de las consecuencias de la actividad PKC es que se fosforila el componente inhibidor del factor NF-k B que estaba retenido en el citoplasma.Al fosforilarse, el componente inhibidor queda a merced de unas proteasas, que lo degradan. Es entonces cuando el NF-k B puede emigrar al núcleo y unirse a secuencias específicas del promotor del gen de IL-2 y de otros genes.

La señal coestimulatoria

Además de las señales suministradas a partir del contacto entre el complejo TCR-CD3 con el péptido-MHC, la activación del linfocito TH requiere una señal adicional, denominada coestimulatoria, que puede consistir en alguna de las siguientes:

·         la citoquina IL-1, suministrada por la célula presentadora de antígeno (APC),

·         la citoquina IL-6, de la APC,

·         pero la señal más potente es la que supone el contacto entre la molécula B7 (=CD80) de la célula presentadora y la CD28 o la CTLA-4 del linfocito TH.

       

B7 (=CD80) consta de dos cadenas idénticas con dos dominios de tipo Ig. Se expresa exclusivamente en células presentadoras de antígeno capaces de estimular a linfocitos T. Se puede presentar en dos versiones estructuralmente parecidas, denominadas B7.1 y B7.2.

La CD28 es una glucoproteína homodimérica, cuyo monómero pesa 44 kDa, presente en linfocitos TH en reposo. Cada cadena presenta un dominio de tipo V-Ig, y está muy glucosilada. Tiene afinidad baja hacia la B7.

        La CTLA-4 está codificada por un gen cercano al de la CD28, presentando ambas grandes homologías. Pero la CTLA-4 sólo se expresa en linfocitos TH activados, siendo su afinidad muy alta hacia la molécula B7. Parece que interviene en las interacciones entre TH y B (a estudiar más adelante, en el tema 12).

La interacción entre CD28 y B7 ejerce un efecto sinérgico sobre la señal transmitida desde el complejo TCR-CD3, de modo que aumenta la producción de IL-2 y la proliferación de linfocitos T coadyuvantes.

Parece que la vía coestimulatoria se basa en la activación de proteín-tirosín-quinasas que activan a la PLCg 1, de modo que se potencia la ruta calmodulina/calcineurina. Por otro lado, las PTK activan un factor de transcripción (CD28R) que mejora los niveles de transcripción de IL-2 y prolonga la vida media de su ARNm.

Activación génica

Resumiendo la idea central emanada del apartado anterior, podemos decir que tras la interacción del linfocito TH con el péptido enclavado en el surco de MHC-II de una célula presentadora de antígeno, se pone en marcha unas rutas que conducen a la activación de una serie de genes.

Pues bien, los genes que se activan se pueden clasificar según el momento relativo de su expresión, en tres categorías:

1.      Genes de expresión inmediata (una media hora). Estrictamente hablando, estos genes no se activan, sino sus productos ya preformados.

2.      Genes de expresión temprana (1 a 2 horas): son esencialmente los que codifican las citoquinas IL-2 (así como el gen de su receptor IL-2R), IL-3, IL-6 e interferón gamma (IFN-g ).

3.      Genes de expresión tardía (hasta 2 días o más): los que codifican ciertas moléculas de adhesión intercelular.

Para que se produzca la expansión clonal de los linfocitos TH se necesita un incremento en la expresión del gen de la interleuquina 2 (IL-2) y de su receptor (IL-2R). En esta tarea interviene una serie de proteínas reguladoras y factores de transcripción que se unen a secuencias específicas de la zona 5’ no codificadora (promotor/intensificador) de los correspondientes genes:

·         complejo AP1 (c-Fos+c-Jun): se une al elemento TRE

·         factor nuclear NF-AT

·         factor {AP1+NF-AT}, que es específico de las células T: se une al elemento ARRES

·         complejo Oct-1+Oct-2+OAP: se une a OBM

·         factor NF-kB: se une a la secuencia kB-RE.

La forma fosforilada (citoplásmica) de NF-AT, al activarse el linfocito T, se desfosforila por la acción de la calcineurina, con lo que se activa y emigra al núcleo; allí forma complejo con AP1, reconociendo una secuencia específica (denominada ARRES) del promotor de los genes de IL-2 y de IL-2R.

Esta desfosforilación del NF-AT se puede inhibir por la acción de drogas como la ciclosporina A (Cs-A) o el FK506:

        La Cs-A forma complejo con la inmunofilina del individuo, y dicho complejo bloquea la acción desfosforiladora de la calcineurina hacia el factor NF-ATc-P. Ello provoca el bloqueo de la activación de los linfocitos TH, con lo que disminuye la intensidad de la respuesta inmune.

Por esta razón estos fármacos se emplean para la inmunosupresión de enfermos trasplantados o con injerto.

ANERGIA CLONAL

La unión de un linfocito TH con un complejo péptido-MHC II de una célula presentadora de antígeno puede conducir a dos tipos de respuestas opuestas:

·         activación y expansión clonal

·         anergia clonal

La anergia clonal es la incapacidad proliferativa de un linfocito tras un contacto con el complejo péptido-MHC, y se debe a la carencia de la señal coestimulatoria proporcionada por la interacción entre CD28 del linfocito TH y B7 de la APC. No se trata de una mera no-respuesta pasiva, sino que la anergia es un estado activo de no proliferación. Para ilustrar estas ideas, nos remitimos a unos experimentos:

1.      Si ponemos en contacto linfocitos TH con APC fijadas por glutaraldehido (y que por lo tanto no expresan moléculas B7 en su membrana), el linfocito entra en anergia. Esto se debe a que aunque ha contactado por su complejo TCR-CD3 con el péptido-MHC (señal #1), la APC no le ha suministrado la señal coestimultoria (señal #2), con lo que el TH produce poca IL-2.

2.      Para confirmar que la anergia es un estado activo, tomemos el linfocito hecho anérgico en el experimento 1) y mezclémoslo con APC normales: pues bien, a pesar de que ahora en principio están disponibles las moléculas implicadas en la señal #2, el linfocito TH sigue sin capacidad de respuesta. Es decir, una vez que un linfocito ha sido hecho anérgico, ese estado se mantiene a pesar de que a posteriori se le suministre la señal coestimuladora.

3.      Para demostrar que la señal #2 (coestimulatoria) es distinta de la señal #1, se puede realizar el siguiente experimento: tomamos linfocitos normales, y los ponemos simultáneamente en contacto con una APC fijada por glutaraldehido y con una APC alogénica (de distinto haplotipo MHC) normal (no fijada). El resultado ahora es que el linfocito se activa de modo normal. Esto se debe a que la APC fijada le suministra la señal #1 específica (dependiente de interacción TCR-péptido-MHC) aunque no la señal #2; pero dicha señal coestimulatoria se la suministra la APC alogénica, que posee su B7.

El requerimiento simultáneo de ambas señales implica que sólo las APC profesionales pueden iniciar las respuestas inmunes dependientes de células T. Ello es importante para evitar la autoinmunidad. Como se recordará, no todos los clones de T potencialmente autorreactivos son eliminados durante la maduración tímica. Los clones que "escapan" podrían en principio reconocer auto-péptidos en cualquier célula propia (señal #1), y luego interaccionar con una APC, que les suministraría la señal coestimulatoria (señal #2), con lo que se activarían, iniciando una peligrosa reacción de autoinmunidad. 

Pero como hemos visto, la realidad es que para que un linfocito T virgen sea activado, se le deben suministrar las dos señales al mismo tiempo y en la misma célula, y este criterio sólo lo cumplen esas células presentadoras profesionales. De esta manera, se evita la autoinmunidad, y de hecho, si la célula T reconoce un autopéptido en ausencia de la señal de B7 entra en anergia, con lo ese clon será autotolerante.

POBLACIONES PERIFÉRICAS DE CÉLULAS T MADURAS

Células T a b

Un 90-95% de las células T periféricas son de tipo a b (o sea, TCR-2), existiendo una proporción de CD4+ doble que las CD8+. En general, las CD4+ funcionan como células T coadyuvantes (TH) y las CD8+ lo hacen como T citotóxicas (TC), aunque parece que ambas poblaciones expresan el mismo repertorio de segmentos variables (Va y Vb ). La población circulante (periférica) de células T consiste en T vírgenes, T efectoras y T memoria.

Linfocitos T vírgenes: resumen de su ciclo de vida y de su activación hasta células efectoras

Las células T CD4+ y T CD8+ vírgenes inmunocompetentes que acaban de madurar abandonan el timo y entran en circulación en un estado de reposo (G0 del ciclo celular). Se caracterizan por:

·         bajos niveles de moléculas de adhesión

·         altos niveles del receptor de alojamiento (homing) llamado L-selectina, que les permite unirse a la dirigina (addressin) vascular de las vénulas de endotelio alto (HEV) de los ganglios linfáticos. Esto permite la extravasación del linfocito virgen hasta el interior del ganglio a partir de la circulación.

·         Expresan la isoforma de alto peso molecular de CD45 (llamada CD45RA), implicada en la transducción de la señal de activación.

Resumen de lo que pasa con los linfocitos T vírgenes una vez que salen del timo:

1.      Los linfocitos T vírgenes recirculan continuamente entre la sangre y la linfa. Poseen la capacidad de extravasarse desde la corriente sanguínea hasta alguno de los órganos linfoides secundarios, debido a las interacciones entre sus receptores de alojamiento y las diriginas vasculares de las HEV de los ganglios y del MALT. En estos órganos establecen contactos cada día con muchas células presentadoras de antígeno. Si no la encuentra, el linfocito T sale del ganglio vía linfático eferente, pasa a circulación, puede entrar a tejidos, y eventualmente regresa al sistema linfático. De esta manera, aumenta la probabilidad de que un linfocito T encuentre la combinación adecuada de péptido:MHC para la que están preparados sus receptores TCR.

2.      Cuando una célula T virgen se encuentra en la paracorteza del ganglio con una APC que le muestra la combinación adecuada de péptido:MHC, deja de migrar, y se embarca en los pasos que le conducirán a ser activada y a producir un clon de linfocitos T "armados" efectores.

3.      Los tres tipos de células presentadoras de antígeno profesionales del ganglio son el macrófago, las células dendríticas interdigitantes y las células B. Estos son los únicos tipos celulares capaces de suministrar la señal coestimulatoria. En próximos temas iremos viendo cómo cada una de estas células cumplen misiones concretas, procesando antígenos de clases diferentes de microorganismos, pero ya podemos ver en los esquemas cómo cada tipo de APC se localiza en una zona o zonas determinadas del ganglio. La producción de T efectoras tarda varios días en producirse, al cabo de los cuales dichas células "armadas" salen del órgano linfoide secundario para emigrar a los sitios de infección, donde ejercerán los efectos pertinentes.

Interacciones celulares que conducen eventualmente a la activación del linfocito T:

·         Cuando las células T emigran a la paracorteza del ganglio, se van uniendo transitoriamente con las APCs que encuentran en su camino. Esta unión inicial es inespecífica, y en ella participan moléculas de adhesión celular: CD2 y LFA-1 de T, que reconocen respectivamente a LFA-3 y las diversas ICAM (ICAM-1, -2 y -3) de la APC.

·         Esta unión es transitoria, y permite que mientras tanto el linfocito T "escrute" grandes números de moléculas MHC de la APC, en busca de la combinación adecuada péptido:MHC.

·         Si no encuentra esa combinación específica, la célula T se despega de la APC y sigue su camino, interaccionando con otras APCs. Al cabo de unos días, si no ha encontrado el pertinente péptido antigénico enclavado en el surco de MHC, abandona el ganglio vía linfático eferente.

·         Si el linfocito T encuentra su combinación péptido:MHC, la señalización a través del complejo TCR-CD3 induce un cambio conformacional en las moléculas de LFA-1, de modo que éstas aumentan su afinidad por las ICAM de la APC. Ello permite a su vez estabilizar la unión específica entre la célula T y la APC, con lo que el contacto entre ambas se prolonga (hasta varios días), de modo que da tiempo a que el linfocito T se active y prolifere hasta diferenciarse en un clon de células T armadas efectoras.

Linfocitos T efectores

Unas 48 horas después de su activación, la célula T se convierte en un blasto  y comienza a proliferar en el ganglio linfático, diferenciándose al cabo de 5-7 días en una subpoblación de células efectoras especializadas y otra subpoblación de T de memoria. Las células T efectoras pueden ser de tres tipos funcionales diferentes:

·         TC: son las T matadoras (citotóxicas), que suelen ser fenotípicamente CD8+.

·         TH1: son las denominadas T inflamatorias, y su papel estriba en activar a macrófagos. Suelen ser fenotípicamente CD4+.

·         TH2: denominadas T colaboradoras o coadyuvantes en sentido estricto, especializadas en secretar ciertas citoquinas que son esenciales en la activación de células B y T. Suelen ser CD4+.

·         Las T se activan en los órganos linfoides secundarios, tras su contacto con las APCs profesionales, contacto en el que reciben las dos señales (la específica y la coestimulatoria).

·         Una de las manifestaciones centrales de la activación del linfocito T es que al final de la compleja cascada de fosforilaciones y desfosforilaciones que vimos se induce la expresión de varios genes, de los cuales los más importantes son el de la IL-2 y el de su receptor (IL-2R).

·         La secreción autocrina de IL-2 por parte del linfocito T suministra las señales iniciales que permiten que éste entre en el ciclo celular (sale de G0): se activa y prolifera, de modo que durante 4 o 5 días de crecimiento rápido se va produciendo un clon expandido.

·         Finalmente, las células procedentes de esta activación y proliferación se diferencian a células T efectoras ("armadas").

Las T efectoras pueden ser de tres tipos, pero aparte de que cada uno posee un arsenal específico, todas comparten una serie de importantes caracteres que las distinguen de las T vírgenes:

·         Sus requerimientos de activación son diferentes a las T vírgenes: ya no necesitan la señal coestimulatoria.

·         Tienen más sensibilidad a la activación, en parte debido al aumento de moléculas de adhesión CD2 y LFA-1.

·         En los humanos, la mitad de las T efectoras pierden la L-selectina (el receptor de alojamiento), por lo que ya no tienden a extravasarse a los órganos linfoides secundarios.

·         En cambio, expresan otra molécula, la VLA-4, que permite que el T efector se una al endotelio vascular cercano al sitio de infección. De esta manera, pueden pasar a los tejidos donde se encuentra el microorganismo invasor, donde ejercerán su papel efector.

Todas las funciones efectoras de las T armadas dependen de que interaccionen adecuadamente con una célula propia, que llamaremos célula objetivo.

·         Las Tc efectoras se suelen denominan linfocitos T citolíticos (CTL), y su célula objetivo es una célula diana, es decir, una célula propia nucleada infectada intracitosólicamente.

·         Las TH1 (inflamatorias) tienen como objetivo a macrófagos que ya contienen en sus vacuolas algún parásito. El efecto de la unión al macrófago será su activación, que le ayudará a eliminar al invasor.

·         Las TH2 (colaboradoras "clásicas") tienen como objetivo principal a los linfocitos B, a los que suministrarán señales claves para que éstos se activen, proliferen y se diferencien hasta células plasmáticas secretoras de anticuerpos.

Rasgos comunes:

1.      La T armada sale del órgano linfoide secundario y emigra a los tejidos donde existe infección, guiada por cambios en la membrana del endotelio ("endotelio inflamado"), que son reconocidos por receptores como el VLA-4.

2.      La primera interacción de la T con su célula objetivo es a través de moléculas de adhesión celular, carentes pues de especificidad antigénica. El hecho de que la T efectora posee niveles superiores de LFA-1 y CD2 hace que se puedan unir mejor a células no presentadoras, que tienen menores niveles de ICAMs y LFA-3 que las APC.

3.      La interacción inespecífica mediante moléculas de adhesión celular es breve, a no ser que en ese pequeño lapso de tiempo, el complejo TCR-CD3-correceptor interaccione con la combinación adecuada péptido:MHC. En este caso, la unión específica provoca un cambio en LFA-1, que hace que la unión entre T y la célula objetivo dure más tiempo, tiempo durante el cual la célula T libera sus moléculas efectoras al estrecho espacio intercelular que separa a ambas células.

4.      En este período de interacción estable desencadenado por la unión específica, la célula T experimenta un notable fenómeno de polarización celular:

·         Se produce la reorganización del citoesqueleto, de modo que tanto el aparato de Golgi como el centro organizador de los microtúbulos se colocan en la zona de citoplasma cercana a la parte de la membrana que está en contacto con la célula objetivo.

·         Los gránulos de la célula T se orientan hacia esa zona de membrana, con la que finalmente se fusionan, liberando su contenido por exocitosis. La consecuencia es que en el estrecho espacio intercelular se produce una gran concentración de esas moléculas efectoras, que al llegar a la célula objetivo desencadenarán una serie de respuestas destinadas a eliminar el parásito.

5.      Esas moléculas secretadas o de membrana producidas de modo polarizado por la célula T son las mediadoras de las funciones efectoras.

6.        Los linfocitos T efectores son de vida corta: al cabo de 2 o 3 días mueren por apoptosis, una vez cumplida su misión, y ante la bajada del nivel de citoquinas activadoras como la IL-2.

Linfocitos T de memoria

·         Los T de memoria surgen como subpoblaciones diferenciadas a partir de la proliferación de T vírgenes y T efectores durante una respuesta primaria.

·         Permanecen en reposo (fase G0) durante mucho tiempo, como una subpoblación expandida, una vez que ha declinado la subpoblación "hermana" de células T efectoras.

·         Están preparadas para responder de un modo más rápido e intenso cuando se vuelvan a encontrar con el antígeno. Ello se debe en parte a que poseen menores requerimientos para ser activadas.

·         En general poseen el mismo tipo de moléculas de membrana que los T efectores correspondientes. De hecho, los T de memoria y los T efectores son difíciles de distinguir entre sí, salvo que los primeros están en fase G0 y tardan más tiempo en responder que los T armados.

·         Recirculan continuamente entre la sangre y la linfa, Al carecer de L-selectina, no se unen a las vénulas de endotelio alto (HEV) de los ganglios. En cambio, tienden al tejido terciario, incluyendo la lámina propia del intestino, superficies epiteliales de pulmones, de piel, etc. En general tienden a emigrar al tejido en el que las células T progenitoras fueron estimuladas durante la respuesta primaria. Esto es un valor adaptativo, ya que es evidente que si un patógeno entró por determinado sitio, es probable que una segunda entrada de ese agente tenga lugar en el mismo tipo de tejido.

Células T g d

Estos linfocitos no fueron descubiertos hasta 1986, en que se reconocieron como una pequeña población de células T periféricas que expresan CD3 pero no el "típico" receptor TCR a b .

Constituyen del 5 al 10% de los T periféricos, y del 1 al 3% de los residentes en ganglios y otros órganos linfoides. Sin embargo, son muy abundantes en la piel, y los epitelios intestinal y pulmonar.

       

 En ratón, hasta el 1% de todas las células epidérmicas son linfocitos T g d , que se conocen con el nombre de células dendríticas epidérmicas (DEC). Dichas células expresan los marcadores Thy-1, g d , CD3, pero no CD4 ni CD8. Proceden del timo.

        En el epitelio intestinal existe una población diferente de linfocitos intraepiteliales (IEL). 

Expresan g d , CD3 y CD8, pero carecen de Thy-1 (que como vimos, es el marcador de linaje de las células T maduradas en el timo). Es probable que no procedan del timo, sino de la médula ósea.

Estos linfocitos epiteliales no recirculan, sino que son residentes fijos en esos tejidos epiteliales. Lo curioso es que en cada tipo de epitelio la población residente de T g d muestra un repertorio muy limitado de reordenaciones de segmentos variables; además proceden de "oleadas" distintas surgidas durante la vida fetal.

   

Hay dos primeras oleadas de células g d , cada una de las cuales se aloja en sitios distintos del animal adulto:

·         la primera oleada usa el segmento Vg 5, y termina alojándose en la epidermis como células dendríticas epidérmicas (DEC).

·         La segunda oleada usa el segmento Vg 6 y va a parar al epitelio del tracto respiratorio.

    Ambas oleadas usan la misma región Jg y emplean el mismo tipo de cadena d . A diferencia de lo que ocurre con las a b , no hay adición de N-nucleótidos (no hay actividad de la desoxinucleotidil-transferasa terminal).

Tras las oleadadas discretas de linfocitos epiteliales tiene lugar una gran oleada continua en la que ya se usan más tipos de segmentos Vg , y ya existe adición de N-nucleótidos. Estos son los linfocitos T g d que se localizan en tejidos periféricos, o como linfocitos intraepiteliales (IEL) del intestino. Pero aún empleando mayor diversidad de receptores, exhiben una gama limitada, preparada para detectar sólo cierto tipo de antígenos.

El papel y significación de estos enigmáticos linfocitos g d es objeto de debates actualmente:

·         Puesto que estos linfocitos expresan en cada epitelio un solo tipo de receptor, y puesto que no recirculan, se ha propuesto que están especializados en reconocer alteraciones de las superficies de las células epiteliales cuando son infectadas por ciertos patógenos; es decir, más que reconocer a cada patógeno concreto, lo que harían sería detectar rasgos "generales" de células epiteliales que indicarían la presencia de infección. Se cree que estos patógenos inducen proteínas anti-estrés (por ejemplo, proteínas Hsp frente al choque por calor), y de alguna manera este tipo de cambio es lo que reconocerían los linfocitos g d .

·         También parece que los linfocitos intraepiteliales tienen una actividad citotolítica constitutiva: pueden matar enterocitos infectados sobre la base de que éstos poseen una expresión aberrante de moléculas de clase IB del complejo MHC. Sin embargo, no parecen estar restringidos por el MHC clásico.

·         Puede que estos linfocitos sean parte de una línea de defensa inespecífica. Se ha sugerido que pueden representar el nivel más temprano y primitivo en la evolución de la inmunidad "específica" mediada por células. Estas T se habrían especializado en reconocer y combatir patógenos que entran por piel o por intestino.

INMUNOGLOBULINAS Y OTRAS MOLECULAS DE CELULAS B

El punto clave del sistema inmune adaptativo es su capacidad de reconocimiento específico de cualquier tipo de molécula o partícula extraña. Para ello, el sistema inmune cuenta con las inmunoglobulinas (Ig) y con los receptores de los linfocitos T (TCR), los cuales exhiben tres importantes propiedades:

·         diversidad

·         heterogeneidad

·         procedencia a partir de reordenaciones de genes.

Las inmunoglobulinas funcionan como:

1.      la parte específica del complejo de las células B, a nivel de membrana, que reconoce al antígeno;

2.      moléculas circulantes, es decir anticuerpos secretados por las células plasmáticas procedentes de activación, proliferación y diferenciación de células B. Estos anticuerpos se localizan en el suero, en los líquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo ciertos epitelios internos. Estas Ig circulantes son los efectores de la rama humoral del sistema inmune específico (de hecho inician la fase efectora, pero como veremos, la eliminación definitiva del Ag no suelen hacerla directamente los anticuerpos).

Los receptores de células T aparecen sólo como moléculas de membrana de los linfocitos T. Reconocen al antígeno restringido por el MHC de la célula diana o de la célula presentadora. Suministran la base de la inmunidad celular específica (en el caso de los linfocitos TC) y del mecanismo de los linfocitos T colaboradores (TH).

APROXIMACIÓN HISTÓRICA AL ESTUDIO DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Porter sometió la IgG a digestión breve con la enzima papaína, tras de lo cual realizó con los fragmentos resultantes una separación cromatográfica en carboximetil-celulosa.

Dedujo que cada molécula de IgG había sido escindida por la papaína en dos fragmentos idénticos, capaces de unir antígeno (fragmentos Fab) y un fragmento cristalizable (Fc).

·         Experimentos de Kabat & Tiselius (1939): demostraron que la llamada fracción g -globulínica de las proteínas del suero era la responsable de la actividad anticuerpo (por eso, a los anticuerpos se les ha denominado durante mucho tiempo como g -globulinas).

·         Porter y Edelman (por separado, en los años 50 y 60) realizaron diversos experimentos usando ultracentrifugación para separar las g -globulinas, obteniendo una fracción que poseía un coeficiente de sedimentación de 7S, a la que llamaron IgG, con un peso molecular de unos 150.000 Da.

·         Nisonoff realizó experimentos parecidos a los de Porter, pero en lugar de digerir la IgG con papaína, empleó pepsina. Del ulterior análisis cromatográfico dedujo que la pepsina había roto cada molécula de IgG en un fragmento capaz de unir Ag pero con doble valencia [fragmento F(ab’)2], y una serie de pequeños fragmentos pequeños no cristalizables, procedentes del Fc original.

·         Edelman sometió la IgG a un tratamiento reductor con mercaptoetanol (que provoca la rotura de los puentes disulfuro), con posterior electroforesis desnaturalizante de los péptidos resultantes. Sus resultados indicaban que la IgG estaba compuesta de dos tipos de cadenas polipeptídicas, una pesada (cadena H) y otra ligera (cadena L).

Ensamblando todos estos resultados se obtenía el primer modelo de la estructura de una inmunoglobulina: cada molécula de IgG está compuesta de

·         Dos cadenas H, cada una de unos 50.000 Da.

·         Dos cadenas L, cada una de unos 25.000 Da.

·         Cada cadena L está unida a una H por un puente disulfuro.

·         A su vez, las dos cadenas H está unidas entre sí por puentes disulfuro.

Estudios de secuenciación de las inmunoglobulinas.

·         El abordaje de la secuenciación de las Ig se encontró con un problema de base: aunque la estructura general de las todas las inmunoglobulinas es parecida, existe una enorme diversidad de secuencias y especificidades frente a distintos antígenos. ¿Cómo obtener y purificar una Ig concreta homogénea que permitiera la secuenciación de sus aminoácidos?

·         En principio hubo que recurrir a muestras de pacientes aquejados de mieloma múltiple: en esta enfermedad un tipo concreto de células plasmáticas (con una especificidad concreta) se ha vuelto canceroso, y secretan grandes cantidades de la correspondiente Ig, que llega a representar el 95% del total de inmunoglobulinas del individuo. Otra ventaja es que los pacientes presentan en la orina las llamadas proteínas de Bence-Jones, que son cadenas L en exceso procedentes del mieloma. De esta forma fueron posibles los primeros análisis de secuencia de las inmunoglobulinas.

·         Recientemente la secuenciación se ha facilitado notablemente por la disponibilidad de los anticuerpos monoclonales.

ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Cadenas L

Cuando se comparan distintas proteínas de Bence-Jones se observa que los 100 a 110 primeros aminoácidos difieren entre unas y otras, mientras que los 100-110 últimos son prácticamente idénticos. Ello permite distinguir dos regiones claramente diferenciables en las cadenas ligeras:

·         región carboxi-terminal, constante (región C)

·         región amino-terminal, variable (región V)

Además, existen dos posibles versiones de cadenas L, según dos variantes en la región C:

·         cadenas k (kappa)

·         cadenas l (lambda)

En una misma Ig existen dos cadenas k o dos cadenas l , pero nunca una de cada tipo. Hay 60 cadenas de tipo K y 40 de tipo I. en la especie humana, existen cuatro subtipos, denominados l 1 a l 4.

Cadenas H

La cadena pesada posee unos 440 aminoácidos (menos dos tipos, que poseen unos 550). Cada cadena pesada posee una región amino-terminal de 100 a 110 aminoácidos, cuya composición es variable (VH). El resto de la cadena H muestra en humanos cinco patrones básicos de secuencia, distinguibles entre sí, que configuran cinco tipos de cadenas pesadas según la porción constante (CH). La longitud de esta porción constante suele ser de 330 aminoácidos, salvo en dos tipos, que poseen 440 aminoácidos.

Cada uno de los tipos de cadena pesada recibe una denominación a base de una letra griega, y determinan lo que se denomina clases o isotipos de inmunoglobulinas:

Cadena h según la posición c	Longitud de la porción (en aminoácidos )	Clase o isotipo de Ig
y	330	IgG
u	440	IgM
a	330	IgA
s	330	IgD
E	440	IgE

En el caso de las IgG e IgA, se pueden distinguir, además, pequeñas diferencias de secuencias dentro de cada clase, que dan origen a subclases, que en humanos son

·         IgG1, IgG2, IgG3, IgG4

·         IgA, IgA2.

En otras especies de mamíferos también se han detectado subclases de IgG e IgA, pero las subclases de las diferentes especies son distintas entre sí. Esto nos sugiere que las subclases han ido apareciendo tardíamente durante la evolución dentro de cada línea filogenética, por lo que no son comparables entre distintas especies.

Cada tipo (o en su caso, cada subclase) de cadena pesada H puede combinarse por separado con cada una de las dos versiones (k o l ) de cadenas L.

Estructura en detalle de las Inmunoglobulinas

Al ser proteínas formadas por dos tipos de cadenas polipeptídicas, en las inmunoglobulinas podemos distinguir estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria:

1.      La estructura primaria (la secuencia lineal de aminoácidos) explica que existan regiones V y regiones C tanto en cadenas H como en L.

2.      Estructura secundaria: existen abundantes láminas b antiparalelas, cada una de ellas formadas por 3 o 4 cadenas b antiparalelas, mantenidas por puentes de hidrógeno entre grupos -NH- y -CO-.

3.      La estructura terciaria es a base de dominios globulares compactos. Cada dominio globular consta de dos capas (láminas) b conectadas entre sí por un puente disulfuro característico. Dos dominios globulares consecutivos se conectan entre sí por secuencias cortas de aminoácidos sin estructura especial.

4.      Estructura cuaternaria: los dominios globulares de cadenas L y H adyacentes interectúan dando la conformación global característica de las inmunoglobulinas.

Cada cadena L se conecta con la H adyacente por un puente disulfuro, a nivel de la parte C-terminal de la cadena L.

Las dos cadenas H se conectan entre sí por al menos un puente disulfuro (como veremos, hay clases y subclases con abundantes puentes disulfuro enlazando las dos cadenas pesadas).

Además, muchas Ig poseen cadenas de polisacáridos unidos covalentemente a algun(os) dominio(s), lo cual evidentemente colabora a la estructra global tridimensional de la molécula.

La estructura cuaternaria de la Ig es la que permite sus dos funciones características: unión al Ag y actividad biológica efectora.

A continuación vamos a describir en detalle la estructura de los dominios de las inmunoglobulinas, comenzando con un estudio general, y continuando con la caracterización de los diferentes dominios o parejas de dominios.

Estructura en detalle de un dominio típico de inmunoglobulina

Cada tipo de cadena (H y L) de Ig se puede considerar formado a partir de dominios globulares elongados. Cada dominio consta de unos 110 aminoácidos, y sus dimensiones son de 2,4 x 4,2 nm. Cada dominio está mantenido por un puente disulfuro que enlaza dos cisteínas invariantes, que en la secuencia lineal están separadas entre sí por unos 60 aminoácidos.

·         Las cadenas L poseen un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL).

·         Las cadenas H poseen un dominio variable (VH) y 3 o 4 (según clase) dominios constantes (CH1, CH2, CH3, y en su caso, CH4).

La estructura en detalle de los dominios pudo ser puesta de manifiesto empleando la cristalografía y difracción de rayos X: cada dominio presenta una estructura compacta característica, denominada pliegue de inmunoglobulina. El hecho de que existan determinados aminoácidos conservados que guardan su posición relativa implica que la estructura.

Esta estructura terciaria peculiar consiste en un "sandwich" de dos láminas b paralelas respecto del eje longitudinal del dominio. Una de las láminas consta de 3 cadenas b antiparalelas, y la otra de 4 cadenas b antiparalelas. Entre dos cadenas b consecutivas existe un bucle, de longitud variable según los casos. Las dos capas b están estabilizadas entre sí por un puente disulfuro conservado (que une dos cys separadas en la secuencia por otros 60 aminoácidos aproximadamente), y por interacciones hidrofóbicas entre grupos químicos de las cadenas laterales de aminoácidos.

        Alguien ha comparado acertadamente esta estructura con un bollo de pan, partido longitudinalmente en dos rebanadas, pegadas entre sí por mantequilla (enlaces hidrófobos) y atravesadas por un palillo de dientes (enlace disulfuro).

El pliegue típico de la Ig condiciona a su vez interacciones no covalentes entre dominios emparejados de dos cadenas diferentes:

·         entre dominios idénticos: CH2-CH2 y CH3-CH3.

·         entre dominios no idénticos: VH-VL y CH1-CL.

Estructura y función de los dominios variables

La variabilidad de secuencia de los dominios variables no está repartida uniformemente, sino en varias regiones denominadas regiones hipervariables:

·         tres regiones en el dominio VL: L1, L2 y L3

·         tres regiones en el dominio VH: H1, H2 y H3.

En cada caso, la suma de estas tres regiones no representa más que el 15-20% del total del dominio. El restante 80-85% es mucho menos variable.

·         Las regiones hipervariables se denominan CDR (iniciales en inglés de regiones determinantes de complementariedad, ya que conjuntamente forman el sitio de unión al epitopo). Cada CDR consta de unos 10 aminoácidos. La CDR3 suele ser la más variable de las tres.

·         Las regiones más constantes se denominan regiones FR, es decir, regiones de armazón o de entramado. Ellas son las que en este caso de los dominios V constituyen la estructura característica de dos láminas b unidas entre sí.

·         Las regiones CDR de las cadenas L y H están situadas espacialmente de modo que se proyectan hacia afuera, y están cercanas una a otra en la configuración global. Esto crea la estructura tridimensional adecuada para la unión con el antígeno.

Obsérvese que la cadena L presenta dos cadenas b adicionales (c’ y c’’), pero su organización global es como acabamos de describir.

Así pues, la región de entramado (FR) suministra un "andamio" que soporta las 6 regiones CDR (tres de cada cadena). Este andamio rígido es el que constituye el dominio globular carácterístico, mientras que el conjunto de las seis CDR de cada brazo Fab suministra una enorme variedad de tipos de Ac, cada uno de ellos con una especificidad antigénica diferente. Dicha especificidad depende de la longitud de las CDR y de la composición de aminoácidos de estas CDRs.

La cristalografía de rayos X de alta resolución se ha aplicado hasta ahora a unos 20 complejos Fab-Ag, lo que ha permitido extraer varias generalizaciones sobre el sitio de unión al Ag:

En el caso de Ag globulares, el Ac contacta con el Ag a través de una superficie amplia (de unos 700-900 Å2), relativamente plana y suavemente ondulada. Obsérvese en las imágenes cómo cada protrusión del Ac se corresponde con una depresión del Ag, y cada depresión del Ac lo hace con una protrusión del Ag.

    En estos casos, 15-20 aminoácidos del Ac contactan con un número similar de aminoácidos de la proteína globular antigénica. Entre 6 y 14% del epitopo se encuentra "enterrado" en alguna hendidura del Ac.

En el caso de antígenos pequeños (p. ej., fosforilcolina, angiotensina-II), el sitio de unión en el anticuerpo es más pequeño (200-700 Å2) y presenta alguna hendidura profunda, donde queda enterrada buena parte del epitopo (70-90%).

De las 6 regiones CDR, al menos cuatro contactan con el epitopo, y frecuentemente lo hacen las seis. En general, parece que la contribución de las CDR de VH es más importante que las de VL.

En algunos casos, la unión Ac-epitopo se produce con cambios conformacionales en uno o en ambos, lo que permite un mejor ajuste entre los dos.

Estructura y función de los dominios constantes

Los dominios constantes de la porción Fc de las Ig están relacionados con diversas funciones biológicas de los anticuerpos. Los dominios constantes se asocian por parejas:

·         CL-CH1

·         CH2-CH2

·         CH3-CH3

Dominios CL-CH1

La interacción no covalente entre ambos dominios es más débil que la que existe entre VL y VH. Sin embargo, CL y CH1 se unen covalentemente entre sí por un enlace disulfuro situado a nivel del extremo C-terminal de la cadena L.

La interacción entre estos dos dominios confiere una serie de propiedades a las moléculas de anticuerpos:

·         La interacción CL-CH1 sirve a su vez para mantener unidos mejor a VL y VH entre sí.

·         La existencia de esta pareja de dominios hace que el brazo Fab (cuya parte esencial para unirse al Ag estriba en los dominios V) sea más largo, lo cual facilita la rotación del brazo, que a su vez mejora la capacidad de interacción del brazo Fab con el Ag.

·         Pueden contribuir a aumentar aún más la diversidad de Ac, al permitir más posibles asociaciones entre VH y VL.

Región bisagra

Las cadenas pesadas de tipo g , a y d presentan entre el primer y segundo dominios constantes una secuencia de aminoácidos sin homología con otros dominios, denominada región bisagra o región Fx. Se trata de una zona rica en prolina, que confiere flexibilidad, y que hace que los dos brazos Fab puedan rotar independientemente uno respecto del otro, formando ángulos variados respecto a Fc.

De esta forma los brazos Fab se pueden mover y girar para alinear mejor las regiones CDR con respecto a los epitopos a los que se van a unir. Igualmente esto permite que la porción Fc se pueda mover para mejorar sus diversas funciones efectoras.

En la región bisagra existen abundantes prolinas, lo cual determina su estructura desplegada, flexible y sensible al ataque por proteasas (recuérdese la actuación de la papaína y la pepsina). Igualmente existen algunas cisteínas, lo cual permite la formación de puentes disulfuro entre las dos cadenas pesadas a este nivel.

Las cadenas pesadas m y e carecen de región bisagra, pero en su lugar poseen un dominio adicional (CH2) 110 aminoácidos, que cumple un papel semejante.

Dominios CH2 de IgG, IgA e IgD (y los equivalentes CH3 de IgM e IgE)

La pareja de dominios CH2 (o su equivalente) suele ser rica en carbohidratos, que suelen estar dispuestos de modo que separan entre sí a cada miembro de la pareja. Es decir, al contrario que las otras parejas de dominios globulares de las Ig, estos dominios no están superpuestos entre sí, sino uno adyacente al otro. Esto supone que estos dominios están más accesibles al entorno acuoso, lo cual explica en parte sus papeles biológicos: en el caso de la IgG y de la IgM activan el complemento por la ruta clásica.

Dominios carboxiterminales (CH3 en IgG, IgA e IgD; CH4 en IgM e IgE)

Aquí hay que distinguir entre las dos posibles versiones en que podemos encontrar cada inmunoglobulina: libre (es decir, anticuerpos circulantes) o Ig de membrana.

·         Los Ac circulantes, tras el típico dominio globular poseen una pequeña porción hidrófila C-terminal. El dominio CH3 (o su equivalente), junto con el dominio anterior, es reconocido por receptores para Fc presentes en diversas células fagocíticas. De este modo, un fagocito puede reconocer y fagocitar fácilmente un microorganismo recubierto por Ac (fenómeno de opsonización).

·         Las Ig de membrana, tras el dominio globular, presentan otro tipo de secuencia más compleja que en la versión circulante, y en la que podemos distinguir tres zonas:

·         un espaciador extracelular (yuxtamembrana), de carácter hidrófilo;

·         una secuencia transmembranal, hidrófoba, de unos 26 aminoácidos, probablemente en configuración de a -hélice.

·         finalmente, una cola intracitoplásmica, hidrófila.

Los papeles biológicos condicionados por este par de dominios son:

·         servir para el reconocimiento por parte de receptores de fagocitos:

·         algunas subclases de IgG se unen a receptores para Fc de la superficie de células de la placenta, lo cual les permite atravesar la barrera materno-fetal y conferir inmunidad pasiva al feto.

·         La IgE se une por este dominio a receptores adecuados de la membrana de basófilos y mastocitos (véase el tema de la alergia).

·         la IgA (y la IgM) interactúan con receptores de células epiteliales durante su proceso de secreción (receptor de poli-Ig).

·         En la IgA e IgM existen ciertas cisteínas en este dominio C-terminal, lo cual condiciona la formación de puentes disulfuro entre dos o más monómeros de estas inmunoglobulinas, creándose formas multiméricas que cumplen papeles especiales.

INMUNOGLOBULINAS DE MEMBRANA Y COMPLEJO RECEPTOR DE CÉLULAS B

Las Ig de membrana (mIg) se diferencian de sus correspondientes versiones circulantes en los respectivos extremos C-terminales. La versión de membrana posee una larga cola en la que existe un segmento extracelular, seguido de una zona transmembranal, de unos 26 aminoácidos, terminando en una secuencia intracitoplásmica de longitud variable, según la clase de inmunoglobulina.

En las distintas fases de maduración de los linfocitos B existen distintos isotipos o combinaciones de isotipos de Ig (todos con la misma especificidad antigénica para cada clon de linfocitos):

·         las células B inmaduras sólo poseen mIgM;

·         las células B maduras vírgenes (en reposo) poseen mIgD y menos cantidad de mIgM;

·         las células B de memoria pueden tener diversas combinaciones de diversas clases: mIgM, mIgG, mIgA y mIgE.

La Ig de membrana va acompañada de otras moléculas, formando el denominado complejo receptor de células C (BCR). Dicho complejo está formado por:

·         una molécula de mIg, unida no-covalentemente a

·         dos heterodímeros Iga -Igb , en los que las dos cadenas (a y b ) están unidas entre sí por puentes disulfuro.

Parece que los dos dominios más C-terminales de la mIg establecen contactos con sendas cadenas a de cada uno de los heterodímeros Iga -Igb .

Las cadenas a y b presentan su correspondiente segmento tranmembranal, así como largas colas citoplásmicas (61 aminoácidos en el caso de la cadena a y 48 la cadena b ).

Cuando un antígeno se entrecruza con las mIg de dos complejos (es decir, uno de los brazos Fab de una mIg se une al Ag y otro brazo Fab de otra mIg se enlaza con el mismo Ag), se inicia una serie secuencial de eventos moleculares en el citoplasma que finalmente conducen a la activación de la célula B: al unirse el Ag a la mIg, parece que ocurren cambios a nivel de la cola citoplásmica de dicha Ig, así como cambios en las colas citoplásmicas de las moléculas invariantes a y b del BCR, poniéndose en marcha una cascada de fosforilaciones y defosforilaciones que finalmente activan una serie de genes, cuya actividad redundará en la activación de las células B.

Recientemente se ha identificado un nuevo complejo de membrana de células B, que puede intensificar la señal de activación transmitida por el BCR. Este grupo de moléculas, que recibe el nombre de complejo correceptor, consta de 3 proteínas:

·         CD19: pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y posee una larga cola citoplásmica y tres dominios extracelulares de tipo Ig;

·         CD21 (también conocida como CR2): se puede unir a C3b (un componente del complemento) y al CD23 de la superficie de las células dendríticas foliculares de los ganglios;

·         CD81 (=TAPA-1): consta de cuatro segmentos transmembranales.

El linfocito B se une por medio del CD21 del complejo correceptor al antígeno acomplejado con C3b o C3d, y por medio de la Ig del BCR al epitopo del antígeno. De este modo el BCR se entrecruza con el correceptor (a través de antígeno unido al componente del complemento). Entonces, este evento provoca que el CD19 del correceptor interaccione con los Iga/Igb del BCR, de modo que se fosforilan varias tirosinas de la cola citoplásmica del CD19. A su vez ello provoca la unión de la quinasa Lyn, que se activa, interviniendo en una cascada de fosforilaciones y desfosforilaciones celulares que finalmente activará una serie de genes del linfocito B.

VARIANTES ANTIGÉNICAS DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Las inmunoglobulinas son glucoproteínas; por lo tanto, se pueden comportar como antígenos al ser inyectados a receptores adecuados. El estudio de las Ig en su faceta de antígenos revela la existencia de tres tipos de determinantes antigénicos, cada uno de ellos localizado en partes características de la molécula:

·         determinantes isotípicos

·         determinantes alotípicos

·         determinantes idiotípicos.

Isotipos y determinantes isotípicos

Se denominan isotipos al conjunto de variantes de inmunoglobulinas comunes a todos los miembros sanos de una determinada especie.

Los isotipos dependen de las regiones constantes tanto de cadenas pesadas como de cadenas ligeras. Los isotipos también reciben el nombre de clases, y en determinados casos se pueden diferenciar subclases. Como ya vimos, en humanos se distinguen cinco isotipos según características de las porciones constantes de cadenas pesadas (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE). Cada isotipo puede encontrarse en dos versiones distintas, según que las cadenas ligeras sean de tipo k o l .

Cada isotipo (y en su caso, cada subclase) viene determinado por un gen correspondiente de región constante. Todos los individuos de una especie cuentan con el mismo juego básico de genes de regiones constantes.

    Los anticuerpos anti-isotípicos se emplean, obviamente, para determinar la clase y subclase de un Ac problema de una especie, así como para caracterizar las Ig de membrana de las células B.

Alotipos y determinantes alotípicos

Los alotipos son el conjunto de variantes alélicas presentes en las poblaciones de una especie: hay individuos que para cada clase o subclase presentan una variante alélica distinta de otros individuos.

Se deben a pequeñas diferencias (de uno a cuatro aminoácidos) que afectan a las regiones CH y CL.

Obviamente, los individuos pueden ser homozigóticos o heterozigóticos para cada variante, siendo estos alelos de expresión codominante.

    En humanos se han identificado 25 alotipos de cadenas g , que se denominan con la letra G seguida del número de la subclase, de la letra m, y finalmente, entre paréntesis, una cifra alusiva al alotipo. Ejemplos: G1m(1), G2m(23), G3m(11), G4m(4 a).

    

Existen dos variantes de IgA2 llamadas A2m(1) y A2m(2).

    Se han identificado tres variantes de cadenas k : k m(1), k m(2) y k m(3).

5.5.3  Idiotipos y determinantes idiotípicos

Se define como idiotipo el conjunto de variantes antigénicas características de cada anticuerpo de un mismo individuo, debidas a las secuencias de aminoácidos de las porciones VH y VL. A su vez, cada uno de los determinantes características de un anticuerpo concreto se denomina idiotopo. El conjunto de los idiotopos es lo que define a cada idiotipo. 

El idiotopo puede coincidir o no con un paratopo (con un sitio de unión a un epítopos). Obviamente, los Ac producidos por un determinado clon de linfocitos B y las células plasmáticas derivadas de ellos llevan el mismo idiotipo.

Normalmente, los distintos clones de linfocitos B producen idiotipos distintos entre sí, no compartidos entre ellos, a los que se llama idiotipos privados.

Pero también puede ocurrir que determinados determinantes idiotípicos sean comunes a dos o más clones, por lo que en este caso se habla de idiotipos públicos o de reacción cruzada (a veces llamados idiotipos recurrentes). Ello se debe a que distintos clones de linfocitos B de un mismo individuo (o de la misma raza pura) pueden usar la misma región génica variable de la línea germinal para construir sus porciones variables.

        Durante una respuesta inmune normal se producen anticuerpos anti-autoidiotípicos, que como veremos en el capítulo sobre regulación (tema 15), tienen un papel importante en el control de la respuesta inmune.

ESTUDIO DE LOS ISOTIPOS HUMANOS DE INMUNOGLOBULINAS

   Inmunoglobulina G (IgG)

Es el isotipo más abundante en suero (8-16 mg/ml), constituyendo el 80% de las Ig totales. Existen cuatro subclases en humanos, que se diferencian estructuralmente entre sí por el tamaño de la región bisagra y el número de puentes disulfuro entre las cadenas pesadas.

SUBCLASE DE IgG	Numero de puentes S-S	Concentración en suero (en mg/ml)	opsoninas	Activación del complemento
IgG1	2	9	+++	++
IgG2	4	3	+/-	+
IgG3	11	1	+++	+++
IgG4	4	0.5	-	-

Estas distintas subclases se deben a que en la línea germinal existen cuatro genes Cg , si bien éstos comparten 90-95% de sus secuencias. Ello nos indica, además, que han divergido hace poco tiempo en la escala evolutiva a partir de un gen ancestral común. Las IgG poseen gran capacidad de desarrollar elevada afinidad de unión al antígeno. Son las mayoritarias durante la respuesta secundaria.

Difunden más fácilmente que los demás isotipos al espacio extravascular (hasta el 50% de las IgG se encuentran en los fluidos tisulares), donde son las principales responsables de neutralizar toxinas bacterianas (de hecho, son las únicas que funcionan como antitoxinas).

Las IgG1 e IgG3 funcionan muy bien como opsoninas: se unen a receptores para Fc de la superficie de células fagocíticas (sobre todo macrófagos), ayudándolas a fagocitar y destruir el microorganismo.

·         La IgG3 > IgG1 > IgG2 activan el complemento por la ruta clásica: el dominio Cg 2 de dos moléculas de IgG se une al componente C1q del complemento, para iniciar la activación de éste.

·         En humanos la IgG1, IgG3 e IgG4 cruzan fácilmente la placenta.

·         En otras especies no humanas (como en el cerdo), las IgG del calostro de la madre es absorbida por el recién nacido desde la luz intestinal hasta la sangre. Ello se debe a que las crías poseen unos receptores únicos en sus células del epitelio intestinal, que reconocen la Fc de la IgG, y la transportan a circulación sanguínea, lo cual confiere inmunidad pasiva durante las primeras semanas de vida.

    Inmunoglobulina A (IgA)

En humanos existen dos subclases: IgA1 e IgA2. En el suero predomina la subclase IgA1, constituyendo del 10 al 15% de las Ig totales (1.4-4 mg/ml), y allí aparece como monómeros (sin embargo, en otros animales, la IgA suele ser dimérica.

Pero en las secreciones seromucosas es muy abundante la IgA2, que aparece como dímero.

        

Para dar una idea de la abundancia de la IgA de las seromucosas, bastará decir que cada día se secretan unos 40 mg/Kg de peso corporal, frente a los 30 mg/Kg de IgG.

Las secreciones donde aparece la IgA secretoria (sIgA) son:

·         saliva

·         lágrimas

·         fluido nasal

·         tracto bronquial

·         tracto genitourinario

·         tracto digestivo

·         leche materna y calostro

La estructura de la sIgA dimérica consta de dos monómeros de IgA2 unidos "cola con cola" por medio de un péptido conocido como pieza de unión (J), y recubiertos por la llamada pieza secretora.

Cada monómero presenta una cola adicional con 18 aminoácidos. La cola de cada monómero se une por un puente disulfuro a la pieza J. Esta pieza J es un polipéptido de 15 kDa sintetizado en la misma célula plasmática que está produciendo la IgA2. Dicha célula plasmática termina secretando el complejo de las dos unidades de IgA unidas cola con cola por la pieza J.

El complejo {IgA-J-IgA} es entonces reconocido por el llamado receptor de poli-Ig, situado en la membrana basal de las células epiteliales. Este receptor de poli Ig pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y está constituido por 5 dominios típicos de Ig, y anclado a la membrana basal epitelial. Parece que reconoce a la pieza J ya engarzada a los dos monómeros de IgA.

El receptor de poli-Ig se une entonces a cada monómero de IgA, probablemente formando puentes disulfuro con los respectivos dominios Ca 2, con lo cual comienza un fenómeno de endocitosis mediada por receptor: se forma una vesícula membranosa recubierta de clatrina, en cuyo interior se encuentra el complejo {IgA-J-IgA} unido a su vez al receptor de poli-Ig. Esta vesícula intracitoplásmica viaja por el citoplasma, desde el extremo basal hasta el apical, y termina fusionándose con la membrana que da a la luz del conducto.

Entonces el receptor de poli-Ig se rompe a nivel del tramo que hay entre el último de sus dominios Ig y la membrana, con lo que queda libre la forma madura de la IgA secretada: un complejo de dos monómeros de IgA unidos por la pieza J, y todo ello recubierto del componente secretor, que como se ve, no es más que la porción mayor escindida del receptor de poli-Ig.

La pieza secretoria recubre buena parte de los dos monómeros de IgA, enmascarando sus respectivas regiones bisagra. Ello hace que la sIgA esté mejor protegida contra las proteasas, lo que se manifiesta en que posea una alta vida media en el entorno del conducto al que ha sido secretada. Además, la IgA2 es intrínsecamente más resistente que otras inmunoglobulinas al ataque de las proteasas bacterianas.

La sIgA cumple una misión importantísima en la protección del organismo frente a la entrada de numerosos agentes patógenos:

·         al tener tetravalencia, es capaz de unirse a epitopos repetitivos de la superficie de virus y bacterias, inhibiendo la colonización por estos de las mucosas.

·         Parece que el componente secretor también tiene el efecto de evitar la adherencia de los microorganismos al epitelio (a esto se le ha llegado a llamar efecto Teflón™.

·         Los complejos de sIgA y antígeno son atrapados eficazmente en el fluido mucoso del epitelio, y eliminados por el movimiento ciliar del tracto respiratorio o por el peristaltismo del intestino.

Inmunoglobulina M (IgM)

Supone del 5 al 10% de las Ig séricas (1.5 mg/ml de media). Se secreta como pentámeros, con las Fc hacia adentro y los brazos Fab hacia afuera.

Cada monómero lleva un dominio constante adicional (el Cm 2). Las unidades del pentámero están unidas entre sí por puentes disulfuro entre dominios Cm 3 adyacentes y entre Cm 4 adyacentes, exceptuando dos de las 5 unidades, que usan unión mediante una pieza J similar a la ya vista para la IgA.

Es la primera inmunoglobulina que sintetiza el neonato por sí mismo, y también es la primera en aparecer durante la respuesta primaria.

Al ser un pentámero, tiene una gran valencia teórica (10), pero dicha valencia sólo se usa al máximo con pequeños haptenos. En el caso de haptenos o epitopos mayores sólo llega a usar 5 de esas valencias, debido a impedimentos estéricos.

El tener gran valencia significa que posee una mayor capacidad que otras Ig para unirse a antígenos particulados multidimensionales: (p. ej., partículas de virus, eritrocitos de otro individuo), entrecruzándolos y provocando aglutinación, por lo que las IgM son típicas aglutininas (son de 100 a 1.000 veces más eficaces que las IgG en este papel).

Al unirse a este tipo de Ag particulados con epitopos repetitivos cambia de conformación: pasa de su configuración plana (forma de estrella) a una en forma de grapa o de cangrejo. Ello parece que a su vez sirve para que se pueda activar eficazmente el complemento por la ruta clásica.

De hecho, fijan y activan muy bien el complemento (debido a que para activar el componente C1q se requieren dos moléculas de inmunoglobulinas cercanas, cosa que la pentamérica IgM logra "por definición"). Por ello, la IgM es muy buena citolítica.

Están confinados en el torrente circulatorio (no se extravasan a tejidos), por lo que son muy buenos frente a bacteriemias.

   Inmunoglobulina D (IgD)

·         Supone el 0.2% de las inmunoglobulinas séricas (20 m g/ml).

·         Presenta una región bisagra bastante amplia, lo que puede ayudar a explicar el hecho de que es muy susceptible a proteolisis, siendo muy baja su vida media en sangre (unos tres días).

·         En su forma libre en plasma, su función es desconocida.

·         Aparece como Ig de membrana, junto con la mIgM, en los linfocitos B maduros vírgenes, donde parece que su función es constituir un receptor antigénico, tanto en activación como en supresión de los linfocitos B.

   Inmunoglobulina E (IgE)

·         Es la menos abundante en suero (0.3 m g/ml)

·         Presenta un dominio adicional (el que pasa a ser el Ce 2).

·         Es la mediadora de las reacciones de hipersensibilidad inmediata (alergias), como la fiebre del heno, asma extrínseco o el choque anafiláctico. Para ello, las moléculas de IgE se unen a receptores específicos para Fc de IgE situados en las membranas de mastocitos tisulares y de basófilos sanguíneos. Cuando dos moléculas de IgE unidas a sus respectivos receptores en estas células se entrecruzan con el alergeno específico, se produce la desgranulación, lo que libera extracelularmente mediadores farmacológicamente activos, como histamina y ciertas citoquinas. También se provoca la síntesis de novo de eicosanoides (prostaglandinas y leucotrienos). Todo ello colabora en los síntomas de alergia.

·         Pero la IgE también juega un papel fisiológico, beneficioso: confiere protección local frente a ciertos patógenos grandes, como helmintos: sirve para reclutar células plasmáticas y efectoras a través de una reacción de inflamación aguda. Si el parásito ha logrado atravesar la barrera de las mucosas y la de la sIgA, puede ser reconocido por moléculas de IgE específicas previamente unidas a receptores de mastocitos. Ello desencadena una reacción de inflamación aguda en la que las aminas vasoactivas (histamina) y los factores quimiotácticos atraen a polimorfonucleares neutrófilos; a continuación entran en el tejido moléculas de IgG, componentes del complemento, granulocitos y eosinófilos. Estos últimos reconocen al parásito recubierto por IgG, y colaboran en su destrucción.

RECEPTORES CELULARES PARA Fc DE LAS Ig

En apartados anteriores hemos venido aludiendo a diversos receptores de la superficie de distintas células que sirven para engarzar inmunoglobulinas a través de las porciones Fc de éstas. Son moléculas ancladas a membrana, y la mayoría de ellos poseen dominios de tipo inmunoglobulina.

Ø Receptores para Fcg

Fcg IR (=CD64)

·         Posee tres dominios de tipo Ig.

·         Presenta una alta afinidad hacia la IgG monomérica y la IgG agregada.

·         Está presente en monocitos, y algo menos en macrófagos sin estimular. La unión de inmunocomplejos {IgG-Ag} al Fcg RI se produce por el dominio Cg 2 del Ac, y elloestimula la muerte extracelular de la célula diana.

Fcg RII (=CD32)

·         Posee dos dominios de tipo Ig.

·         Presenta baja afinidad hacia la IgG.

·         Aparece en la superficie de monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, células B y plaquetas.

·         No es capaz de unir IgG monomérica, pero es muy efectivo para captar inmunocomplejos. El entrecruzamiento de varios de estos receptores con inmunocomplejos provoca la activación de la célula respectiva, que en el caso de las células fagocíticas supone un aumento de esa actividad fagocitadora, y en el caso de las plaquetas, un aumento de la trombosis.

·         Por otro lado, los linfocitos B presentan una isoforma, que cuando se une a inmunocomplejos provoca la regulación negativa de estas células B.

Fcg RIII (=CD16)

·         Es un receptor con dos dominios de tipo Ig.

·         De baja afinidad.

·         Presente en macrófagos, células NK, neutrófilos y eosinófilos.

·         Responsable del mecanismo ADCC de las células NK y de la eliminación de los inmunocomplejos por parte de los macrófagos.

Fcg Rn

·         A diferencia de los anteriores, no pertenece a la familia de las inmunoglobulinas, sino a la del MHC-I (posee incluso b 2-microglobulina).

·         Presente en la cara luminal de las células del epitelio intestinal de neonatos de ciertas especies de mamíferos.

·         Sirve para captar IgG de la leche materna en crías de ratones y de otros animales, y transportarlos al lado basal, de donde irán a la circulación.

·         Existe otro receptor, aún mal caracterizado, en las células del sincitiotrofoblasto (en la placenta), que permite el paso de IgG al feto.

Ø Receptores para Fce

Fce RI

·         Consta de tres tipos de cadenas polipeptídicas: una a (con dos dominios de tipo Ig), una b y dos cadenas g unidas por puentes disulfuro.

·         Está presente en mastocitos.

·         La cadena a se une muy ávidamente al dominio Ce 2 (es decir, el dominio adicional de la IgE). La cadena b y las dos g parecen intervenir en la transducción intracelular de la señal.

·         El entrecruzamiento de dos receptores Fce IR (cada uno con su correspondiente molécula de IgE) con un mismo alergeno provoca la desgranulación del mastocito, iniciando la reacción de hipersensibilidad de tipo I (alergia).

Fce RII

·         No pertenece a la familia de las Ig, sino que presenta homología con varias lectinas animales, como la proteína de unión a la manosa (MBP).

·         Tiene baja afinidad hacia la IgE.

·         Presente en células inflamatorias y linfocitos B.

·         Se une al dominio Ce 3.

LA SUPERFAMILIA GÉNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Estas proteínas están codificadas por genes que presentan homologías entre sí. Estos diferentes genes probablemente se originaron a partir de un gen ancestral que codificaba algo parecido al dominio de Ig.

A nivel de proteína, el dominio de Ig posee, de 100 a 110 aminoácidos, con un bucle característico entre dos cisteínas conservadas y separadas entre sí por unos 50 a 70 aminoácidos, y que forma en el espacio una estructura terciaria globular elongada a base de dos láminas b antiparalelas.

La evolución molecular, a partir del dominio ancestral de tipo Ig ha generado tres tipos de variantes:

·         dominios de tipo V: se parecen al dominio variable de las inmunoglobulinas;

·         dominios de tipo C1: su prototipo es el dominio constante de las inmunoglobulinas;

·         dominios de tipo C2: poseen rasgos intermedios entre los dominios V y C1.

Son muy abundantes los ejemplos de proteínas codificadas por miembros de esta superfamilia génica:

·         Cadenas H y L de las inmunoglobulinas.

·         Cadenas Iga e Igb del complejo BCR.

·         Cadenas del receptor de linfocitos T (TCR).

·         Cadenas g d e del complejo CD3, que acompaña al TCR.

·         b 2-microglobulina, que forma parte del MHC-I.

·         Dominio proximal del MHC-I.

·         Dominios proximales del MHC-II.

·         CD2, CD4, CD8, CD28 de los linfocitos T.

·         Receptor de poli-Ig (y su versión "recortada" componente secretor de la sIgA).

·         Varias moléculas de adhesión celular (VCAM, ICAM, etc.).

·         PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas).

Se ha lanzado la hipótesis de que ya los invertebrados poseen moléculas de adhesión celular con dominios de tipo Ig. Probablemente en los primitivos vertebrados se produjeron repetidas duplicaciones y diversificaciones evolutivas del gen ancestral, de modo que la selección natural encontró una nueva utilidad a algunas de las moléculas resultantes en ese gran logro evolutivo que ha sido el sistema inmune de los vertebrados. Un rasgo común de todas estas proteínas es que, al igual que la proteína primitiva ya existente en invertebrados, son capaces de facilitar interacciones y contactos entre proteínas ancladas a membrana de distintas células (una reminiscencia de su papel original como moléculas de adhesión celular). Como ejemplos de interacciones entre distintos miembros de proteínas o dominios de estas superfamilia tenemos:

·         VH-VL

·         CH1-CL

·         CH3-CH3

·         poli Ig-Fc de IgA e IgM

·         CD4-MHC II

·         CD8-MHC I

·         TCR-MHC

·         Iga /Igb –mIg.

Complejo mayor de histocompatibilidad

Todas las especies de mamíferos tienen un grupo de genes estrechamente ligados y muy polimórficos, que fue descubierto por su implicación en el rechazo o aceptación de transplantes o injertos de tejidos u órganos; de ahí deriva su nombre de Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC, del inglés Major Histocompatibility Complex).

Pero obviamente, su papel fisiológico (natural) no puede ser ese (al fin y al cabo, la evolución no pudo prever que una especie - la humana- se fuera a dedicar a hacer transplantes). Las moléculas codificadas por el MHC intervienen de un modo central en el desarrollo de las respuestas inmunes específicas, tanto la humoral como la celular:

·         Las moléculas del MHC juegan un papel esencial en el reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos T (tanto los coadyuvantes, TH, como los citotóxicos, TC).

·         El juego particular de moléculas MHC de cada individuo (determinado por el conjunto de alelos de los genes MHC que posee) influye sobre el repertorio de epítopos que pueden reconocer sus linfocitos TC y TH. Por ello, la capacidad de respuesta frente a los patógenos (es decir, la mayor o menor susceptibilidad a la enfermedad infecciosa) y los fenómenos de autoinmunidad dependen parcialmente de esa dotación concreta de alelos del complejo MHC.

ORGANIZACIÓN GENÉTICA Y HERENCIA DEL COMPLEJO MHC

El MHC es un conjunto de genes alineados en una región grande y continua del genoma: en la especie humana se sitúa en el cromosoma 6, y se conoce como región HLA.

Se pueden apreciar tres grandes zonas, que determinan tres tipos de moléculas:

1.      Genes de clase I (MHC-I): determinan glucoproteínas de membrana que aparecen en casi todas las células nucleadas, que sirven para presentar antígenos peptídicos de células propias alteradas a los linfocitos T citotóxicos (TC).

2.      Genes de clase II (MHC-II): determinan glucoproteínas de membrana de células presentadoras de antígeno (macrófagos, células dendríticas, linfocitos B), y que sirven para presentar antígenos peptídicos a linfocitos T coadyuvantes (colaboradores; TH).

3.      Genes de clase III (MHC-III): no todos ellos tienen que ver (aparentemente) con el sistema inmune, pero entre los que sí tienen papeles inmunológicos cabe citar los genes de proteínas del complemento, y el del factor de necrosis tumoral (TNF).

El complejo MHC es bastante grande: ocupa unos 2- 3 cM, es decir, unos 4 millones de pares de bases (un 0.8% del genoma). La región HLA-I cubre unos 2.000 kb, mientras que la HLA-II supone unos 900 kb.

Haplotipos del MHC

Los distintos loci del complejo MHC están estrechamente ligados: ello se refleja en el hecho de que p. ej., en el H-2 de ratón sólo se detecte un 0.5% de recombinación interna.

En cada especie de mamífero los distintos loci del MHC son muy polimórficos; de hecho poseen la mayor variabilidad genética intraespecífica detectada en la Genética de Poblaciones. Es decir, cada locus concreto del complejo MHC posee multitud de variantes alélicas dentro de las poblaciones naturales de cada especie.

Cada individuo hereda un juego de MHC del padre y otro juego de la madre, cada uno con sus distintos alelos. Cada juego completo de alelos heredado de un progenitor se denomina haplotipo.

En una población natural panmíctica (es decir, en la que los cruces son al azar) los individuos de cada generación descendientes de los parentales suelen ser heterozigotos en múltiples loci del MHC.

Los dos alelos de cada locus son de expresión codominante: esto significa que un individuo heterozigoto para los distintos loci del MHC expresará en sus células al mismo tiempo los dos tipos de variantes alélicas de cada locus.

En laboratorio podemos lograr cepas de animales (p. ej., ratones) consanguíneas (endogámicas) que son homozigóticas para todo el complejo H-2. (Véase la tabla para ejemplos de cepas consanguíneas de ratones).

Ciertas razas consanguíneas y homozigóticas para H-2 se han denominado con superíndices, para facilitar la nomenclatura:

        Ejemplos:           

·         el prototipo de H-2k es la raza CBA

·         el prototipo de H-2d es la raza DBA/2

·         el prototipo de H-2b es la raza B10

MOLÉCULAS Y GENES DEL MHC DE CLASE I

Las moléculas de clase I constan de:

·         una cadena larga (a ): glucoproteína de unos 45 kDa, polimórfica, transmembranal, codificada por los loci de tipo I (en humanos HLA-A, HLA-B, HLA-C; en ratones K, D/L, Qa, Tla);

·         una cadena corta, denominada b 2-microglogulina (b 2-m), de 12 kDa, invariante, codificada por un gen que no forma parte del complejo MHC.

Las moléculas MHC-I funcionan para presentar a linfocitos TC péptidos procedentes de procesamiento de antígenos proteicos, por células del propio individuo.

La cadena a poseer una cola citoplásmica (carboxi-terminal), de unos 30 aminoácidos, un segmento transmembranal hidrófobo, de unos 40 aminoácidos, y tres dominios extracelulares, cada uno de unos 90 aminoácidos: uno proximal (a 3), que es de tipo Ig, dotado de su puente disulfuro característico, y dos distales (a 2, a 1), dotado el a 2 de un puente disulfuro.

La cadena b 2-microglobulina posee un solo dominio globular de tipo inmunoglobulina, y se asocia no covalentemente con el dominio a 3 de la cadena larga.

La reciente cristalización y consiguiente análisis por difracción de rayos X del complejo soluble (es decir, la porción extracelular, escindida por papaína) demuestra los siguientes detalles estructurales:

Los cuatro dominios (tres de la cadena a y el único de la b 2-m) interactúan dos a dos:

·         Interacción a 1- a 2:

·         Los dos dominios más externos (a 1 y a 2), que son polimórficos, interactúan para generar una notable estructura tridimensional: una plataforma plana formada por 8 cadenas b antiparalelas, de la que sobresalen, abarcándolas, dos largas hélices a ligeramente arqueadas. (Su aspecto se puede comparar con el de una especie de plato que soporta dos plátanos).

·         Dicha estructura deja un surco profundo entre las dos hélices a , que tiene unas dimensiones de 25x10x11 C . Este surco o hendidura es el sitio destinado a albergar el péptido procesado: tiene una capacidad para péptidos entre 8 y 20 aminoácidos.

·         Interacción a 3 - b 2-m:

·         Estos dos dominios sólo interaccionan mediante enlaces no-covalentes, siendo ambos típicos dominios globulares de tipo Ig, estabilizado cada uno por en característico enlace disulfuro intracatenario.

·         El dominio a 3 está bastante conservado entre las moléculas MHC-I, y contiene una secuencia que será reconocida por la molécula CD8 de la membrana de los linfocitos T CD8+.

·         La b 2-microglobulina interacciona ampliamente con el dominio a 3, y con algunos aminoácidos de a 1 y a 2. Todas estas interacciones son necesarias para que la MHC-I adquiera su configuración cuaternaria adecuada para cumplir su misión.

Aparte de estas interacciones, es importante aludir al hecho de que cuando el péptido procesado se une a la hendidura de los dominios a 1+a 2 esto favorece a su vez que el dominio a 3 interaccione correctamente con la b 2-microglobulina.

Cada uno de los genes de clase I (en humanos HLA-A, HLA-B, HLA-C) está organizado de un modo carácterístico:

·         L = exón que codifica el péptido guía

·         Intrón

·         exón para a 1

·         intrón

·         exón para a 2

·         intrón

·         exón para a 3

·         intrón

·         Tm = exón del segmento transmembrana

·         Intrón

·         C =  dos exones que codifican conjuntamente la porción citoplásmica, separados por intrón

Unión entre el péptido procesado y la molécula MHC de clase I

En una situación fisiológica normal la hendidura de las moléculas de clase I de las células nucleadas está ocupada por péptidos procedentes del procesamiento de proteínas del propio individuo, degradadas en el citoplasma de la propia célula.

Si la célula es infectada por virus o es cancerosa, algunos de los péptidos propios que estaban unidos a MHC-I son desplazados por péptidos procedentes de procesamiento endógeno de las proteínas alteradas.

La unión entre MHC-I y los péptidos no tiene la especificidad de la unión Ag-Ac, y se dice que es de tipo promiscuo:

        Se ha calculado que cada célula nucleada posee unas 100.000 moléculas de los diversos tipos de MHC-I. Cada variante de cada tipo reconoce unos 500 péptidos endógenos diferentes. Cuando la célula es infectada por un virus, algunos de los péptidos propios son desplazados por péptidos procedentes de procesamiento de proteínas del virus.

·         una determinada molécula MHC-I puede unirse con muchos tipos de péptidos diferentes; ahora bien, cada tipo concreto de MHC-I, y concretamente, cada variante alélica, sólo puede unirse a una gama relativamente amplia, pero limitada, de péptidos, pero no a otros.

·         Cada forma alélica de cada tipo de molécula de clase I es capaz de unirse a un "juego" característico de péptidos y no a otros.

¿Tienen algo en común todos estos péptidos? ¿Cómo es la unión entre ellos y la molécula del MHC-I?

·         La mayoría de los péptidos que se han aislado tras separarlos artificialmente de moléculas de MHC-I a los que estaban unidos son nonámeros u octámeros, pero también se pueden unir péptidos de 7 aminoácidos o de 10 aminoácidos, si bien lo hacen con 100 o 1.000 veces menor eficiencia.

·         Cada versión alélica de MHC-I tiende a reconocer cierta longitud media de péptidos, y dentro de ellos, ciertos aminoácidos conservados en determinadas posiciones.

·         Los datos obtenidos por cristalografía de rayos X de co-cristales formados entre MHC-I y péptido sugieren lo siguiente:

·         la hendidura del MHC-I está cerrada por ambos extremos, lo que explica la limitación del tamaño del péptido admisible.

·         Ambos extremos de la hendidura del MHC-I poseen aminoácidos conservados que interaccionan con los aminoácidos en posiciones 1,2 y 8, 9 respectivamente del péptido (y que se denominan como aminoácidos de anclaje).

·         En esta situación, el péptido adopta una configuración bastante extendida (desplegada, poco compacta), en la que más del 70% está "enterrado" en el surco. Sin embargo, péptidos más largos pueden arquearse en su parte central para acomodarse mejor a la hendidura de la molécula MHC de clase I.

·         Dentro del surco, las configuraciones de un péptido endógeno normal y de un péptido de un virus son muy similares.

·         En la cristalografía quedan moléculas de agua que interaccionan con la porción central "elevada" del péptido, lo que sugiere que esta zona es la más hidrófila y accesible, por lo que es la mejor candidata a ser la que establezca contacto con el receptor TCR del linfocito T.

MOLÉCULAS Y GENES DEL MHC DE CLASE II

Las moléculas MHC de clase II se expresan sólo en la superficie de células presentadoras de antígeno (macrófagos, células dendríticas y linfocitos B), y sirven para presentar péptidos procesados procedentes de antígenos exógenos a los linfocitos T CD4+.

Las moléculas MHC de clase II son glucoproteínas unidas a membrana, con dominios extracelulares, segmento transmembrana y cola citoplásmica. En la siguiente tabla se muestran las formas isotípicas en ratón y en humanos, junto con sus equivalencias.

Cada molécula de clase II está formada por dos cadenas, una a y otra b , que se asocian entre sí de forma no covalente.

·         La cadena a tiene unos 33 kDa, y consta de dos dominios globulares (el amino-terminal, a 1, sin puentes disulfuro, y el a 2 de tipo Ig, con su puente disulfuro), un segmento transmembrana y finalmente una cola intracitoplásmica.

·         La cadena b , de unos 28 kDa consta de un dominio aminoterminal (b 1) con puentes disulfuro (pero no de tipo Ig), seguido por el dominio b 2 de tipo Ig (con puentes disulfuro), segmento transmembrana y cola intracitoplásmica.

Los dominios distales respecto de la superficie celular (a 1 y b 1) interaccionan entre sí de modo no covalente, formando la estructura que se une a péptidos derivados de procesamiento intracelular por vía endocítica de antígenos exógenos. Entre los dos forman una estructura tridimensional bastante parecida a la de los dos dominios distales de la cadena a del MHC-I:

·         ocho plegamientos b antiparalelos que forman el "suelo" de la hendidura

·         dos cadenas a -helicoidales que forman los "brazos" o paredes laterales de dicha hendidura.

Los péptidos que se albergan en el surco de MHC-II son más largos que los de la clase I: de 13 a 20 aminoácidos. Esto parece que se debe al hecho de que la hendidura de MHC-II no está tan cerrada por sus extremos. Los péptidos no tienen por qué encajar entre los límites de esta hendidura, sino que pueden sobresalir de ellos (aspecto de un perrito caliente).

Al igual que en MHC-I, las moléculas de clase II pueden unirse a un juego amplio pero finito de péptidos, de modo que cada variante alélica tiene una gama de péptidos a los que se engarza. Cuando se cristalizó el MHC-II humano (1993) se vio que aparecía como dímeros del heterodímero ya citado, es decir, {a b }2. Los dímeros están situados de modo que las hendiduras respectivas están enfrentadas.

POLIMORFISMO DE LAS MOLÉCULAS DEL COMPLEJO MHC

En cada especie, existe una enorme diversidad de alelos diferentes para cada locus del complejo MHC; de hecho estamos ante el complejo de genes más polimórfico de los vertebrados.

      

  Observar que esto es diferente a lo que ocurre con lo visto en el caso de las inmunoglobulinas y lo que estudiaremos del TCR, en los que la diversidad surge en cada individuo por mutaciones y reordenaciones somáticas. En el caso de MHC estamos hablando de diversidad a escala poblacional, no individual.

Se ha deducido que deben de existir unos 100 alelos diferentes para cada locus polimórfico del MHC. 

La variación entre alelos distintos de un mismo locus del MHC, a nivel de secuencia de aminoácidos del respectivo producto, es de 5 al 10%, mucho más alta que en un gen "normal", y superior incluso a la diferencia de secuencia entre algunos genes homólogos de especies distintas. La variación se concentra sobre todo en los dominios más distales.

CARTOGRAFÍA DEL MHC

El MHC humano (sistema HLA) mide unas 4.000 kb, continuas dentro del brazo corto del cromosoma 6. Los primeros estudios genéticos recurrieron al uso de ratones congénicos normales y congénicos recombinantes, basándose en la serología (reacciones Ag-Ac) y funcionalidad de estas moléculas.

Más recientemente, el recurso a las técnicas del ADN recombinante in vitro (clonación en cromosomas artificales de levadura, YAC) y de la secuenciación han permitido cartografiar totalmente y obtener la secuencia completa de nucleótidos de este complejo.

EXPRESIÓN CELULAR DE LAS MOLÉCULAS MHC

Expresión de MHC-I

En general, aparecen moléculas de clase I en todas las células somáticas nucleadas, aunque en cantidades diversas según los tipos celulares:

·         los linfocitos poseen los mayores niveles (500.000 moléculas por célula)

·         menos abundantes en hígado, riñón y pulmones

·         apenas nada en cerebro y músculo esquelético

·         nada en células de la placenta (trofoblasto velloso).

Cada célula nucleada de un organismo sano expresa en su superficie varios tipos de moléculas MHC de clase I, y cada uno de ellos (correspondiente a uno de los numerosos alelos posibles) se une a una gama de péptidos propios procedentes de procesamiento citosólico de proteínas normales de la propia célula. Cuando la célula es infectada por un virus, algunos de los péptidos propios unidos a las hendiduras del MHC-I son desplazados por péptidos del virus igualmente procedente de procesamiento intracitoplásmico.

·         Cada célula infectada por un determinado virus tiene varios tipos de MHC-I en su membrana, y cada tipo (de cada versión alélica) despliega un juego diferente de péptidos de ese virus.

·         Ahora bien, otro individuo de la misma especie (dotado de otro juego diferente de alelos de MHC-I, es decir, de otro haplotipo) desplegará en el surco de sus moléculas de clase I un conjunto diferente de péptidos de ese virus.

        Expresión de MHC-II

Las moléculas de clase II sólo aparecen en ciertos tipos de células, a saber, aquellas que funcionan habitualmente o pueden funcionar eventualmente como células presentadoras de antígenos:

·         monocitos y macrófagos: expresan bajos niveles de MHC-II, pero al interaccionar con el antígeno inducen altos niveles

·         células dendríticas

·         células de Langerhans de la piel

·         células B maduras

·         células T activadas

Debido a que cada molécula de clase II consta de una cadena a y otra b , cada una codificada por un gen distinto de la región II del MHC, y debido a que los dos alelos de un locus del heterozigoto son codominantes, la asociación aleatoria de cadenas a y b de cada alelo puede dar origen a combinaciones de moléculas MHC-II homólogas o heterólogas.

       

Cada célula presentadora de antígenos de ratón tendría 8 tipos posibles de moléculas de clase II, y en humanos habría 12 combinaciones teóricas. Pero en realidad, existen aún más combinaciones, ya que en el complejo MHC hay múltiples genes para cadena a en cada locus, y también varios genes de cadena b para cada locus de clase II.

Esta heterozigosis en el ámbito fenotípico probablemente supone un aumento en el número de péptidos diferentes que pueden ser presentados en el sistema inmunitario de cada individuo.

EXPRESIÓN Y REGULACIÓN GÉNICAS DEL COMPLEJO MHC

El ARN mensajero de cada cadena se traduce en ribosomas unidos al retículo endoplásmico rugoso. Tras la escisión del péptido líder y entrada del resto de la cadena al lumen del retículo endoplásmico, se produce la maduración al transitar el polipéptido desde este retículo al aparato de Golgi (adición de oligosacáridos); finalmente, el péptido madurado (que en su caso se habrá asociado con otros péptidos), viaja en vesículas membranosas que se fusionan con la membrana citoplásmica, lo que permite la inserción en esa membrana de las moléculas de MHC. En el capítulo siguiente veremos que las moléculas MHC no viajan solas desde el RE hasta la superficie, sino que requieren una serie de proteínas imprescindibles para su adecuado ensamblaje y para que se inserten los péptidos dentro del surco.

Últimamente se está investigando bastante en los aspectos de regulación genética de los genes del complejo MHC. Los promotores están dotados de típicas "cajas TATA" y a menudo cuentan con secuencias de tipo CAAT. Se han identificado diversos intensificadores (enhancers) con secuencias conservadas que interaccionan con proteínas reguladoras específicas.

Se sabe que los genes de MHC pueden ser regulados tanto de modo positivo como negativo. Por ejemplo:

·         el MHC-I aumenta su expresión ante interferón g y factor de necrosis tumoral (TNF). Además, los interferones a y b y el interferón no inmune (el g ) activan la transcripción de otros genes que también participan en las respuestas mediatizadas por el MHC: el gen de la ß2-microglobulina (que no pertenece al complejo MHC) y los genes TAP, que aun estando dentro de la zona del MHC-II, codifican proteínas de transporte requeridas para introducir péptidos antigénicos en el interior del retículo endoplásmico rugoso. Obviamente, el significado adaptativo de este control genético positivo estriba en que permite aumentar la cantidad de moléculas MHC de clase I capaces de presentar péptidos derivados de algún parásito intracelular (como un virus), para que sean reconocidos por los linfocitos T CD8+.

·         El interferón g (pero no el a ni el b ) induce aumento de la transcripción de los genes de clase II, por medio del llamado transactivador de MHC de clase II (abreviadamente, CIITA).

·         El MHC-I puede ver modificada su expresión ante productos de ciertos virus. Tal es el caso de una proteína virásica del citomegalovirus (CMV), que se une a la b 2-microglobulina, impidiendo que se transporten cadenas a desde el REr a la membrana. El virus de la hepatitis B (HBV) bloquea ciertos factores de transcripción de genes de MHC-I.

        

El posible significado biológico de esto es que el virus así es capaz de evadirse de la respuesta inmune, al disminuir la probabilidad de que las células infectadas presenten el antígeno a los linfocitos citolíticos.

MHC Y SUSCEPTIBILIDAD A ENFERMEDADES INFECCIOSAS

La importancia adaptativa del polimorfismo MHC en una población es que tiende a proteger a la especie frente a agentes infecciosos, ya que amplía la variedad de antígenos que se pueden reconocer. Cuando por alguna circunstancia disminuye el grado de polimorfismo del MHC, aumentan los riesgos de enfermedades infecciosas en las poblaciones. En ciertos casos se ha llegado a determinar qué alelos son los responsables de la susceptibilidad o resistencia.

El polimorfismo de cada locus dentro de poblaciones normales hace que las poblaciones resistan el ataque de gran variedad de patógenos, aunque algunos individuos dotados de alelos poco aptos para determinado parásito puedan verse afectados.

  

En determinadas áreas geográficas donde permanentemente existen determinados parásitos, la presión selectiva puede hacer que se seleccionen aquellos alelos MHC más eficientes para presentar péptidos: en el oeste de África, donde la malaria es endémica, es muy abundante el alelo HLA-B53, que está asociado a una mayor supervivencia ante el parásito.

Complejo mayor de histocompatibilidad

Es una región de genes muy polimórficas las cuyos genes se expresan en la superficie de varias células. Son proteínas indispensables para que unidos al AG  produzcan una respuesta inmunológica.

1950 se hubieron realizados transplantes de órganos, en pacientes en los cuales habían múltiples transfusiones, tenían un AC en las cuales las glucoproteinas expresadas en la parte superior de los leucocitos y se produzco a una misma vez rechazo de tejidos en las cuales se comprobó que inducían a la proliferación clonal de L.T.

HLA y los genes se dividen en tres:

HLA clase I: se encuentran en todas las células somáticas.

HLA clase II: se expresan en LB  macrófagos células dendríticas, células de Langerhans, y algunas células LTA.

HLA clase III: grupos variados  de proteínas incluyen del  C.

Los alelos se dividen en:

Clase I: HLA –A, HLA-B, HLA-C,  aquí se presenta en cd8.

Clase  II: HLA- DR ALFA, HLA-DP BETA, HLA-DQ ALFA, HLA-DR ALFA AQUÍ SE ENCUENTRA EL  CD4 (COOPERADORES).

MHC: tienen como función presentar las moléculas a los linfocitos T para realizar su función reconocimiento diferenciación y defensa.

Vacunas

La disciplina de la inmunología tiene sus raíces en las primeras pruebas de vacunación que efectuaron Edward jenner y Louis .La incidencia de enfermedades como difteria, sarampión, tos ferina, rubeola, poliomielitis y tétanos ha disminuido de manera impresionante al volverse mas frecuente la vacunación contra esos padecimientos. En ningún otro caso han sido tan grandes los beneficios de la vacunación como en el de la erradicación de la viruela, uno de los flagelos mas prolongados terribles del hombre. El último caso registrado de poliomielitis adquirida de manera natural en el hemisferio occidental ocurrió en Perú en el 1991y la organización mundial de la salud pronostica que poliomielitis se erradicara del mundo en unos cuantos años más.

Es costoso, largo y tedioso el camino para lograr con buenos resultados el desarrollo de una vacuna que pueda aprobarse para la aplicación humana, elaborar con un costo razonable y poner con eficiencia a la disposición de las poblaciones en riesgo. Es por completo necesaria la investigación mediante pruebas estrictas, ya que las vacunas se administran a grandes números de personas sanas. 

El desarrollo de una vacuna se inicia con investigación básica. Progresos recientes en inmunología y biología molecular. Han culminado en la elaboración de nuevas vacunas eficaces y la institución de medidas promisorias para encontrar nuevas vacunas vacunas candidatas.

Se puede lograr inmunidad contra los microorganismos infecciosos mediante inmunización activa o pasiva. En cada caso la inmunidad se adquiere por procesos naturales transferencia desde la madre hacia el feto o infección previa por el patógeno o medios artificiales como inyección de anticuerpos o vacunas.

La inmunización salva millones de vidas y cada vez se dispone de más vacunas viables. El desafío para la comunidad de investigación biomédica consiste en desarrollar formas de estas vacunas mejores, más seguras, más baratas y más fáciles de administrar para que la inmunización mundial se convierta en una realidad.

La inmunización pasiva consiste en transferencia de anticuerpos preformados

Se reconoce a jenner y Pasteur como los iniciadores de la vacunación o la inducción de inmunidad activa, pero se debe un reconocimiento similar a Emil von behring e hidesaburo kitasato por sus contribuciones ala inmunidad pasiva. Estos investigadores fueron los primeros en demostrar que la inmunidad desencadenada en un animal podía transferirse a otro si se le inyectaba suero del primero. 

La inmunización pasiva es la que se transfieren anticuerpos preformados a un receptor, se produce de manera natural con la transferencia de anticuerpos maternos atreves de la placenta hacia el feto de desarrollo.

Se adquiere también inmunización pasiva al inyectarse al receptor anticuerpos preformados.

En el caso de ciertas enfermedades  como la insuficiencia respiratoria producida en niños por el virus sincitial respiratorio (RSV), la inmunización pasiva es la mejor mediada preventiva disponible en la actualidad.se puede suministrar un anticuerpo monoclonal o una combinación de dos anticuerpos monoclonales  a los niños que están en riesgo de sufrir enfermedad por (RSV).

Estos anticuerpos monoclonales se preparan en ratones, pero han humanizado mediante inserción de las regiones constante de IgG humana en las regiones virales del ratón.

La inmunización activa confiere protección prolongada

Mientras que la afinidad de la inmunización  pasiva es la protección transitoria o el alivio de un trastorno existente, la de la inmunización activa  es conferir inmunidad  protectora  y memoria inmunológica.

La vacunación de los niños se inicia luego de los dos meses de edad. Además de que el programa recomendado de inmunizaciones infantiles en estados unidos  actualizado en el  2002 por la american academy of pediatrics .el programa incluye  las siguientes  vacunas:

§  Vacuna de la hepatitis B.

§  Vacuna combinada de difteria, tos ferina  (acelular) y tétanos (DPaT).

§  Vacuna inactiva contra la poliomielitis.

§  Vacuna combinada  de sarampión, parotiditis y rubeola MMR).

§  Vacuna de varicela zoster.

§  Vacuna neumónica conjugada (PCV); esta es una nueva  adición a la lista.

Diseño de las vacunas para la inmunización activa

Deben recomendarse diversos factores para el desarrollo de una vacuna con buenos resultados. En primer lugar, y ante todo, el desarrollo de una reacción inmunitaria, no significa en todos los casos, que se consigue un estado de inmunidad  protectora. Un segundo factor es el desarrollo  de memoria inmunológica.

La función de las células de memoria depende en parte del período de incubación del agente patógeno, en el caso del virus de la influenza , que tiene un periodo de incubación muy breve (uno o dos días ) los síntomas de la enfermedad se encuentran en desarrollo en el momento en que se activan las células de memoria .

Vacunas con microorganismos enteros

Los virus y las bacterias atenuados  producen inmunidad sin enfermedad

En algunos casos es posible atenuar algunos microorganismos  de modo que pierden su capacidad  para causar afección de consideración (patogenicidad) pero retengan una capacidad para crecer de manera transitoria dentro de un huésped inoculado.

La vacuna sabe de la poliomielitis, constituida por tres cebas atenuadas de virus, se administra por vía oral a niños en un cubito de azúcar o un líquido azucarado. Con la primera inmunizada predomina el crecimiento de una cepa. Con la segunda inmunización, la inmunidad generada por la inmunización previa limita el crecimiento de la primera cepa de la vacuna que predomino. Por ultimo después de la tercera el individuo adquiere inmunidad contra las tres cepas. Una desventaja de primera importancia de las vacunas atenuadas es la posibilidad de que los microorganismos retornen a su forma virulenta. 

La vacuna sal inactivada alternativa debe sustituirse conforme disminuye el número de casos aunque se tienen problemas para proveer esta vacuna a los países desarrollo. Las vacunas atenuadas pueden relacionarse con complicaciones semejantes a las observadas durante la enfermedad natural. Y las técnicas de ingeniería genética ofrecen una manera de atenuar al virus de manera irreversible al remover de manera selectiva genes que son necesarios para su virulencia. En fecha más reciente se desarrollo una vacuna contra el rotavirus, causa de primera importancia de la diarrea infantil, mediante técnicas de ingeniería genética para modificar un rotavirus de los animales que contiene antígenos de lis rotavirus humano.

LOS MICROORGANISMOS SE INACTIVAN MEDIANTE TRATAMIENTO CON CALOR O PRODUCTOS QUÍMICOS

            Otro criterio frecuente para la elaboración de vacunas es la inactivación del agente patógeno mediante calor o sustancias químicas, de tal modo que no sea capaz de multiplicarse en el huésped. Es de importancia conservar la estructura de los epítopos sobre los antígenos de superficie durante la inactivación. Por lo general, la inactivación por calor es insatisfactoria porque produce desnaturalización extensa de las proteínas. Ha tenido también buenos resultados la inactivación química con formaldehido o diversos agentes alquilantes.

            Las vacunas atenuadas suelen requerir sólo una dosis para inducir inmunidad duradera. Las vacunas de microorganismos muertos requieren a menudo refuerzos repetidos para conservar el estado de inmunidad del huésped. Estas vacunas inducen una reacción de anticuerpo de predominio humoral y tienen menos eficacia que las de microorganismos atenuados para inducir inmunidad mediada por células y desencadenar una reacción secretoria de IgA.

MACROMOLÉCULAS PURIFICADAS COMO VACUNAS:

            Se utilizan en la actualidad tres formas generales de estas vacunas exotoxinas inactivadas, polisacáridos capsulares y antígenos microbianos recombinantes.

SE EMPLEAN COMO VACUNAS CÁPSULAS POLISACÁRIDAS BACTERIANAS:

            La virulencia de algunas bacterias patógenas depende sobre todo de las propiedades antifagocíticas de su cápsula polisacárido hidrófila. Cubrir la cápsula con anticuerpos, complemento o ambas cosas incrementa de manera notable la capacidad de los macrófagos y los neutrófilos para fagocitar a estos microorganismos patógenos.

            Una limitación de las vacunas polisacáridos es la incapacidad para activar las células TH. Activan las células B del tipo 2 (TI-2) de una forma independiente del timo, lo que tiene como consecuencia producción del IgM pero poco cambio de clase, maduración nula de la afinidad y poco desarrollo, en el mejor de los casos, de células de memoria.

            El conjugado de polisacárido y proteína es mucho más inmunógeno que el polisacárido por sí sólo y, puesto que activa las células TH, permite el cambio de clase desde la IgM hacia la IgA. Aunque este tipo de vacuna puede inducir células B de memoria, no lo puede hacer con célula T de memoria específica para el agente patógeno.

LOS TOXOIDES SE ELABORAN A PARTIR DE TOXINAS BACTERIANAS:

            Algunas bacterias patógenas, como las causantes de difteria y tétanos, producen exotoxinas. Éstas originan muchos de los síntomas de enfermedad que son resultado de la infección. Las vacunas de difteria y tétanos, por ejemplo, se pueden elaborar mediante purificación de la exotoxina bacteriana u, a continuación, inactivación de ésta con formaldehido para formar un toxoide. La vacunación con el toxoide induce la formación de anticuerpos antitoxoide, que son también capaces de fijarse en toxina y neutralizar sus efectos.

LAS PROTEÍNAS DE LOS AGENTES PATÓGENOS SE PRODUCEN POR TÉCNICAS RECOMBINANTES:

            El gen que codifica cualquier proteína inmunógena, se puede clonar y expresar en células bacterianas, de levaduras o mamífero mediante tecnología recombinante del DNA. La primera vacuna de antígeno recombinante de esta clase obtenida y aprobada para la administración al ser humano fue la vacuna de la hepatitis B. Ésta se desarrolló mediante clonación del gen para el antígeno mayor de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) y expresión de éste en levaduras. Las células de levaduras recombinantes se hacen crecer en grandes sistemas fermentadores y se acumula HBsAg en ellas. A continuación estas células se cosechan y desintegran mediante gran presión, para que liberen el HBsAg recombinantes, que de manera subsecuente se purifica por las técnicas bioquímicas ordinarias.

EL EMPLEO DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS COMO VACUNAS HA PROGRESADO CON LENTITUD:      

            Los péptidos no son tan inmunógenos como las proteínas y es difícil conferir inmunidad humoral o mediada por células contra ellos. El empleo de conjugados y coadyuvantes puede contribuir a la producción de inmunidad contra los péptidos, pero aún hay barreras para el empleo generalizado de vacunas peptídicas que plantean un problema de gran interés a los inmunólogos.

          

  La elaboración de péptidos sintéticos para utilizarlos como vacunas que tienen como finalidad inducir inmunidades humoral o mediada por células requiere conocimientos sobre la naturaleza de los epítopos de las células T y B. Las vacunas para inducir inmunidad humoral deben incluir péptidos que forman epítopos inmunodominantes en células. Estos epítopos se pueden identificar al determinar el anticuerpo dominante en los sueros de individuos que se recuperan de un padecimiento infeccioso. 

Una vacuna que tiene buenos resultados debe crear además una población de células TH de memoria; por este motivo, el péptido debe contener epítopos dominantes de células T.

Vacunas recombinantes con vectores

Se pueden introducir genes que codifican antígenos mayores de agentes patógenos en particular virulentos o bacterias atenuados. El microorganismo atenuado funciona como vector, se multiplica en el huésped y expresa el producto génico del agente patógeno.

Se inyecta DNA plásmido codificador de proteínas antigénicas de modo directo en el músculo estriado del receptor. Las células musculares captan DNA y expresan el antígeno proteínico codificado, lo que precipita una reacción de inmunidad humoral y otra mediada por células. Las células musculares captan y expresan el DNA inyectado con una eficiencia mucho mayor que la observada en el cultico tisular. La proteína codificada se expresa en el huésped en su forma natural, la reacción inmunitaria se dirige contra el antígeno del mismo modo como lo expresa el agente patógeno. Las vacunas de DNA producen expresión prolongada del antígeno, lo que crea una memoria inmunológica considerable.

Los aspectos prácticos: No requiere refrigeración. El mismo vector plásmido puede diseñarse de acuerdo con la necesidad. Pueden emplearse las mismas técnicas para la fabricación de las vacunas de DNA.

Un método mejorado para la administración de estas vacunas consiste en cubrir partículas microscópicas de oro xon DNA del plásmido y, a continuación introducirlas a través de la piel hasta el músculo subyacente mediante una pistola de aire. Esto hace posible la administración rápida de una vacuna a grandes poblaciones sin necesidad de reservas gigantescas de agujas y jeringas.

Las vacunas de DNA son capaces de conferir inmunidades protectoras contra diversos agentes patógenos. Ciertas secuencias de DNA en el vector desencadenan una reacción inmunitaria intensificada. Solo pueden codificarse antígenos proteínicos y consisten en antígenos polisacáridos protectores.

VACUNAS DE SUBUNIDADES MULTIVALENTES

 Una de las limitaciones de las vacunas de péptidos sintéticos y de las de proteínas recombinantes es que tienden a ser deficientes. Es menos probable que induzcan una mediada por células. Lo que se necesita, es un método para elaborar vacunas de péptidos sintéticos que contengan apitopos inmunodominantes de células B y T. Un criterio consiste en preparar complejo de matriz solida, anticuerpo y antígeno mediante fijación de anticuerpos monoclonales a matrices salidas en partículas y, a continuación saturar el anticuerpo con el antígeno deseado. Después se emplean los complejos resultantes como vacunas. Se ha demostrado que estos complejos multivalentes provocan reacciones humorales y celulares intensas. Su naturaleza en partículas contribuye a la inmunogenicidad que poseen al facilitar la fagocitosis por las células del huésped. Se mezclan las proteínas en el detergente y a continuación se forman micelas al retirarlo. Las proteínas se orientan por si mismas de manera individual. Las proteínas se incorporan en la bicapa con los residuos hidrófilos expuestos. Los complejos inmunoestimulantes (ISCOM) son portadores lipídicos preparados al mezclar una proteína con detergente y un glucósido denominado Quil A. Se han incorporado en micelas, liposomas e ISCOM proteínas de membrana de diversos agentes patógenos, como virus de la influenza, virus del sarampión, virus de la hepatitis By HIV, y se han valorado como vacunas potenciales.

Preguntas con repuestas de la página 453 y454

1.      Se ha informado  una relación  entre la vacuna neumococica por  una forma relativamente rara de artritis. ¿Qué datos son necesarios para validar este informe? ¿debe valorarse esta posible relación?                                            Respuesta:   verdadera

2.     ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de utilizar microorganismos
atenuados como vacunas?

Repuesta: Como los microorganismos atenuados proliferan de manera

Limitada en las células hospedadoras, se procesan por la vía citosólica Y se presentan en la membrana de las células hospedadoras No infectadas junto con las moléculas MHC clase I.

3.     Una niña pequeña nunca antes inmunizada contra el tétanos
pisó un clavo oxidado que le provocó una herida punzante profunda.
El médico limpió la herida y administró una inyección
de antitoxina tetánica.
a. ¿Por qué se prescribió antitoxina en vez de una dosis de refuerzo?
b. Si la niña no recibe tratamiento ulterior y vuelve a lesionarse
con un clavo oxidado tres años más tarde, ¿es inmune
contra el tétanos?

Respuesta: (a) La antitoxina se administró para desactivar cualquier toxina que pudiera producirse en caso que Clostridium tetani infectara

La herida. La antitoxina era necesaria porque la niña no se había Inmunizado antes y en consecuencia no tenía anticuerpo Circulante contra la toxina del tétanos ni células B de memoria Específicas para la toxina del tétanos. (b) Por el tratamiento con Antitoxina, la niña no desarrollará inmunidad contra el tétanos Después de la primera lesión. Por ello, después de la segunda Lesión, tres años más tarde, necesitará otra dosis de antitoxina. Para desarrollar inmunidad prolongada debe vacunarse con toxoide tetánico.

4. ¿Cuáles son las ventajas de la vacuna Sabin contra la poliomielitis
en comparación con la vacuna Salk? ¿Por qué no se recomienda
más la vacuna Sabin en Estados Unidos?

Respuesta: La vacuna Sabin para polio es atenuada, mientras que la vacuna Salk es desactivada. Por tanto, la vacuna Sabin tiene las ventajas Usuales de una vacuna atenuada en comparación con una

Desactivada (véase respuesta 2). Además, si la vacuna Sabin es Capaz de cierta multiplicación limitada en el conducto gastrointestinal,

Induce la producción de IgA secretoria. La vacuna Sabin atenuada puede causar infección potencialmente letal en Personas como niños con SIDA cuyo sistema inmunitario está gravemente suprimido.

5. ¿Por qué la vacuna contra la gripe a base de virus vivos atenuados
no causa infección respiratoria?

Respuesta: Las cepas del virus usado para las vacunas de administración Nasal son mutantes termosensibles que no pueden proliferar a La temperatura del cuerpo humano (37°C). El virus vivo atenuado

Puede proliferar en las vías respiratorias superiores para Inducir inmunidad, pero no en las vías respiratorias inferiores Para causar gripe.

6. En un intento por desarrollar una vacuna de péptido sintético
se analizó una secuencia de aminoácidos de un antígeno
proteínico para identificar a) los péptidos hidrófobos y b) los
péptidos muy hidrófilos. ¿De qué manera los péptidos de cada
tipo podrían emplearse como vacunas para inducir reacciones
inmunitarias diferentes?

Respuesta: Los epítopos de células T casi siempre son péptidos internos,

que a menudo contienen una alta proporción de residuos hidrófobos.

En contraste, los epítopos B se localizan en la superficie De un antígeno, donde se encuentran accesibles al anticuerpo, y Contienen una alta proporción de residuos hidrófilos.

7. Explique el fenómeno de la inmunidad colectiva. ¿De qué manera
se relaciona este proceso con la aparición de ciertas epidemias?

Respuesta: Cuando la mayor parte de una población es inmune a un patógeno Particular (es decir, hay inmunidad de grupo), la Probabilidad de que unos cuantos miembros susceptibles de La población entren en contacto con un individuo infectado es Muy baja. Por tanto, no es probable que los individuos susceptibles Se infecten con el patógeno. 

8. Explique las relaciones entre el período de incubación de un
patógeno y el criterio necesario para lograr la inmunización
activa eficaz.

Respuesta: Los patógenos con período de incubación corto (p. ej., virus de La gripe) causan síntomas de enfermedad antes que la respuesta de las células de memoria se induzca. La protección contra Tales patógenos se logra mediante inmunizaciones repetidas para mantener niveles altos de anticuerpo neutralizante.

9. Señale los tres tipos de macromoléculas purificadas que se utilizan
en la actualidad como vacunas.

Respuesta: Polisacáridos de la cápsula bacteriana, exotoxinas bacterianas Desactivadas (toxoides) y antígenos proteínicos de superficie.

Los últimos dos a menudo se producen mediante tecnología De DNA recombinante. Además está en evaluación el uso de Moléculas de DNA para dirigir la síntesis de antígenos con la Inmunización.